亚硝酸盐胁迫下植物乳杆菌 WU14亚硝酸盐还原酶的食品级高效诱导表达及其酶学性质研究

【目的】研究亚硝酸盐胁迫下植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）WU14亚硝酸盐还原酶（nitrite reductase，NirS）的作用机制，为发酵食品中应用乳酸菌纯种培养技术降解亚硝酸盐奠定基础。【方法】在37℃培养条件下，测定含0.02%—0.16%NaNO2的 MRS 培养液中 L. plantarum WU1424 h 的生长密度、pH 及 NaNO2降解量。通过 PCR 扩增和 TA 克隆得到 NirS，并克隆到乳酸乳球菌食品级细胞内高效诱导表达载体 pRNA48中，获得重组菌L. lactis NZ9000/pRNA48-NirS。重组菌经30 ng·mL-1 nisin 诱导后，经 SDS-PAGE 和盐酸萘乙二胺法分析目的蛋白的表达情况及 NirS 酶活。通过生物信息学软件预测分析 NirS 编码的蛋白质二三级结构、跨膜结构及疏水性。【结果】L. plantarum WU14能够在 NaNO2浓度小于0.12%的 MRS 培养基中生长并降解一部分 NaNO2，在0.10% NaNO2培养液中发酵24 h 后降解量达到最大，为56.34μg·mL-1，NirS 酶活达2347.5 U·mL-1。NirS 编码的蛋白质是一种以α-螺旋和无规则卷曲为主，不存在信号肽和跨膜结构的亲水蛋白。NirS 可在 L. lactis NZ9000中高效表达，该重组菌能够在 NaNO2浓度低于0.10%的 GM17培养基中生长并降解一部分 NaNO2，在含0.04%NaNO2的培养液中亚硝酸盐降解量达到最大，为22.21 mg·mL-1，NirS 酶活为925.41 U·mL-1。【结论】L. plantarum WU14的 NirS 能够降解高浓度的亚硝酸盐，并且经食品级异源表达的 NirS 具有较高的酶活力。本研究为探索研究亚硝酸盐降解的机理，建立发酵食品中亚硝酸盐降解的可控发酵体系提供了参考。