去甲基化酶ALKBH5高、低表达食管鳞癌细胞株的构建

目的 构建高、低表达去甲基化酶ALKBH5的食管鳞癌(ESCC)细胞株.方法 将生长状态良好的人源胚胎肾细胞293T于培养瓶内培养,分别记为A、B、a、b、c组,待细胞融合80％～90％后进行质粒转染,A组293T细胞转染高表达ALKBH5的质粒pLV-ALKBH5,B组293T细胞转染对照质粒pLY-con,上述2个质粒中均带有GFP蛋白和Flag标签蛋白(用于后续感染细胞的筛选);a组293T细胞转染低表达ALKBH5的质粒pLKO-shALKBHS-1,b组293T细胞转染低表达ALKBH5的质粒pLKO-shALKBH5-2,c组293T细胞转染对照质粒pLKO-shSCR,上述3个质粒中均带有嘌呤霉素抗性(用于后续感染细胞的筛选).上述各组293T细胞质粒转染72 h后,分别收集细胞上清液,离心后分装;用A、B组细胞上清液分别感染ESCC细胞株(Eca109细胞和Kyse510细胞),采用流式细胞术筛选GFP蛋白(+)的细胞待测;用a、b、c组细胞上清液分别感染ESCC细胞株(Eca109细胞和TE-13细胞),用嘌呤霉素筛选细胞待测.采用qRT-PCR法和Western blotting法分别检测感染高、低表达ALKBH5上清液的ESCC细胞中ALKBH5 mRNA和蛋白.结果 感染A组细胞上清液的Eca109细胞、Kyse510细胞中ALKBH5 mRNA和蛋白的相对表达量均显著高于感染B组细胞上清液的Eca109细胞、Kyse510细胞(P均＜0.05),感染a、b组细胞上清液的Eca109细胞、TE-13细胞中ALKBH5 mRNA和蛋白的相对表达量均显著低于感染c组细胞上清液的Eca109细胞、TE-13细胞(P均＜0.05).结论 成功构建高、低表达ALKBH5的ESCC细胞株,为进一步探讨ALKBH5在ESCC发生发展中的作用提供了细胞模型.