高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法用于重组人促红素中唾液酸的含量测定

目的 建立高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法(HPAEC-PAD)测定重组人促红素(rhEPO)中唾液酸含量的方法.方法 将rhEPO样品用5mmol/L的磷酸盐缓冲液(pH 7.0)换液后,调整浓度到0.33 mg/mL,取20 μL样品溶液加入10 mU/μL的神经氨酸酶20 μL,37℃孵育1h后,加入0.04 mmol/L的尤罗索尼克酸(KDN)内标物50 μL,再加入70 μL超纯水,混匀后分析测定.采用CarboPac PA1分析柱,CarboPac PA100保护柱,流动相为150 mmol/L氢氧化钠与125 mmol/L乙酸钠混合溶液,柱温30℃,流速1.0 mL/min,等度洗脱,数据采集时间15 min.根据唾液酸峰面积与KDN内标峰面积的比值与含量的量效关系,计算样品中的唾液酸含量.结果唾液酸标准品浓度在0.0015～0.0075 μg/mL范围内与唾液酸峰面积与KDN内标峰面积的比值呈良好的线性关系,R2＞ 0.99;重复性RSD＜ 4％;(低、中、高浓度)样品回收率分别为94.9％、94.3％、96.7％.用建立的HPAEC-PAD法测定了6批rhEPO中唾液酸含量,与间苯二酚测定法测定结果比较差异无统计学意义(P=0.7488).结论本研究建立了rhEPO中唾液酸含量测定的HPAEC-PAD方法,该方法线性、重复性、稳定性良好,适用于rhEPO的唾液酸含量的常规测定.