高通量筛选酸敏感离子通道1a 抑制剂研究

目的：建立体外稳定过表达酸敏感离子通道1a（ASIC1a）的 Fisher 大鼠甲状腺上皮细胞（FRT 细胞），采用 Ca2＋敏感荧光染料Fura-2/ AM和细胞毒性检测〔乳酸脱氢酶（LDH）释放法〕测定 ASIC1a 活性，探讨高通量筛选ASIC1a 抑制剂的可行性。方法2014年1月—2016年2月，利用分子生物学方法，构建 ASIC1a 过表达载体pcDNA3.1/ myc-His-mASIC1a，通过细胞转染技术建立了稳定过表达 ASIC1a 的 Fisher 大鼠 FRT 细胞。将细胞分成两组，对照组（ FRT 细胞）和实验组（稳定过表达 ASIC1a 的 FRT 细胞），并分别未负载和负载 Ca2＋敏感荧光染料Fura-2/ AM，采用酶标检测仪测定双波长（340 nm 和380 nm）的值，计算 F340/ F380。对照组和实验组细胞经不同 pH值酸液（pH 值7.5、7.0、6.5、6.0、5.5）刺激后，采用酶标检测仪测定450 nm 波长处 LDH 释放量。结果对照组与实验组未负载Fura-2/ AM细胞 F340/ F380比较，差异无统计学意义（ P ＞0.05）；实验组负载Fura-2/ AM细胞 F340/F380较对照组升高（P ＜0.05）；对照组和实验组负载Fura-2/ AM细胞 F340/ F380较未负载Fura-2/ AM细胞升高（P ＜0.05）。pH 值6.5、6.0、5.5时，实验组细胞 LDH 释放量大于对照组（P ＜0.05）；对照组和实验组细胞不同 pH 值时LDH 释放量比较，差异有统计学意义（P ＜0.05）。结论本研究成功建立稳定过表达 ASIC1a 的 FRT 细胞，Ca2＋敏感荧光染料Fura-2/ AM和细胞毒性检测（LDH 释放法）两种方法测定 ASIC1a 活性，使高通量筛选 ASIC1a 抑制剂成为可能，为发现高选择性和高活性的天然小分子 ASIC1a 抑制剂奠定了基础。