慢病毒转染荧光蛋白 EYFP-H148Q/I152 L细胞模型的构建

目的：构建稳定表达EYFP荧光蛋白的 HeLa细胞作为阴离子（卤素）通道阻断剂筛选的细胞模型，为高通量筛选阴离子（卤素）通道阻断剂提供条件。方法通过基因重组技术构建表达YFP突变蛋白（EYFP‐H148Q／I152L）和puromycin抗性的慢病毒载体。将慢病毒载体和包装质粒混合物转染包装细胞293T 细胞产生慢病毒颗粒，感染HeLa细胞，进一步利用抗性基因对细胞进行puromycin筛选，纯化细胞并扩增至所需细胞量。采用实时定量PCR和Western blot方法检测目的基因EYFP‐H148Q／I152L的表达效率。并验证EYFP‐HeLa稳转细胞系作为卤族离子通道阻断剂筛选模型的活性。结果基因测序验证了目的基因成功插入慢病毒载体。RT‐PCR和Western blot检测结果显示，目的基因在 HeLa细胞中实现了过表达。荧光显微镜下观察到 EYFP‐HeLa稳转细胞株能够表达特有的EY FP黄色荧光，效率接近100％。碘离子（I－）（低渗）溶液刺激细胞阴离子（卤素）通道的开放，内流的I－能够使黄色荧光淬灭。结论构建的EYFP‐HeLa细胞系能够稳定表达EYFP黄色荧光蛋白，对内流入细胞的 I－敏感，可以作为理想的阴离子（卤素）通道阻断剂的筛选模型。