利用Red重组系统在腺病毒大质粒上快速实现单碱基点突变

目的 在包含腺病毒全基因组40 kb的大质粒上快速实现单碱基突变.方法 通过重叠PCR方法扩增出含有突变位点的打靶DNA,将腺病毒大质粒和打靶DNA共同转化入Red高重组率大肠杆菌中,通过菌落PCR联合酶切鉴定的方法,筛选到携带突变位点大质粒的菌株.并将得到的突变大质粒再次转化入质粒高稳定菌株DH10B中,以保持质粒骨架的稳定性.结果 通过该法在腺病毒的9171位点和24410位点连续引入了2个单碱基突变.酶切鉴定了骨架质粒的稳定性,测序结果显示突变位点正确.结论 成功建立了一种快速在40 kb的腺病毒大质粒上实现单碱基突变的技术,阳性突变位点检出率在5%~15%,该法的建立为研究腺病毒的毒理作用提供了技术平台.