MDM2拮抗剂对p53野生型急性髓系白血病细胞株杀伤作用机制探讨

目的 多数急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)的TP53表型为野生型,但p53功能常常被过表达的MDM2所抑制.本研究探讨p53-MDM2结合小分子拮抗剂Nutlin3对p53野生型急性髓系白血病细胞株OCI-AML3和MOLM13的杀伤作用及其机制.方法 CCK8法检测不同浓度Nutlin3对OCI-AML3及MOLM13细胞的增殖抑制作用,Annexin Ⅴ/PI及JC-1法检测不同浓度Nutlin3诱导OCI AML3和MOLM13细胞的凋亡情况,蛋白印迹法检测Nutlin3处理后线粒体凋亡通路相关蛋白PUMA、NOXA和PARP的表达变化.结果 CCK-8细胞毒性实验结果显示,0.625、1.25、2.5、5、10 μmol/L的Nutlin3处理OCI-AML3细胞48 h抑制率分别为(19.26±0.09)％、(34.49±0.07)％、(21.54±0.14)％、(33.05±0.13)％和(72.48±0.07)％,上述浓度Nutlin3作用MOLM13细胞48 h的抑制率分别为(12.48±0.05)％、(26.71±0.01)％、(62.44±0.07)％、(84.28±0.06)％和(94.13±0.02)％,Nutlin3对OCI-AML3和MOLM13细胞具有明显的增殖抑制作用,呈剂量依赖性;Kruskal-Wallis检验分析表明,与对照组相比,1.25～10 μmol/L的Nutlin3处理OCI-AML3细胞与MOLM13细胞IC50分别为(5.53±2.86)和(2.03±0.23) μmol/L,差异均有统计学意义,x2值分别为6.485和79.68,P值分别为0.004和＜0.001.凋亡实验显示,Nutlin3能增加OCI-AML3及MOLM13细胞凋亡率,0.625、1.25、2.5、5、10 μmol/L的Nutlin3作用OCI-AML3细胞48 h凋亡率分别为(1.79±1.86)％、(1.29±1.74)％、(4.19±2.45)％、(10.21±3.65)％和(30.03±5.26)％,与对照组比较差异有统计学意义,x2=15.38,P=0.009;上述浓度Nutlin3作用MOLM13细胞48 h凋亡率分别为(2.33±0.13)％、(7.14±2.95)％、(30.79±7.25)％、(47.68±1.70)％和(59.64±8.75)％,与对照组比较差异有统计学意义,x2=58.37,P＜0.001. JC-1法检测线粒体膜电位变化结果显示,Nutlin3能显著降低线粒体膜电位,2、4、8μmol/L的Nutlin3 JC-1多聚体/单体比值分别为0.44±0.01、0.41±0.01和0.23±0.02,与对照组(0.55±0.02)比较差异有统计学意义,P＜0.001.蛋白印迹结果显示,Nutlin3能促进p53及其下游的促凋亡蛋白PUMA和NOXA的表达,活化Caspase-3;Z-VAD-FMK能部分挽救Nutlin3所导致的凋亡.说明Nutlin3介导的OCI-AML3细胞死亡部分通过Caspase依赖的凋亡而实现.结论 Nut-lin3可能通过活化p53诱导线粒体凋亡通路从而诱导p53野生型AML细胞株的凋亡,抑制其增殖.