活化转录因子3基因Cas9编辑慢病毒载体的构建及鉴定

目的:构建靶向活化转录因子3(ATF3)在CRISPR/Cas9技术编辑的慢病毒载体.方法:针对ATF3基因设计并合成三条对应的向导(gRNA)序列和一条无意义序列,向导RNA序列与双酶切U6-EF1a-Cas9-FLAG-P2A-EGFP载体链接,DNA测序鉴定重组载体.荧光/绝对定量法测定慢病毒浓度.共转染人微血管静脉内皮细胞(HMEC)后,实时定量荧光PCR检测ATF3 mRNA表达,验证HMEC细胞中是否含有ATF3基因及其是否有突变.对照病毒和三个靶点慢病毒分别感染Cas9蛋白稳定株,感染后混合克隆进行抽提基因组DNA,将得到PCR产物进行错配酶法进行酶切,对于筛靶中阳性的PCR产物一组序列与野生型对比.Western blot检测ATF3蛋白表达,验证转染效果.定量PCR检测ATF3mRNA的改变.结果:测序表明ATF3在Cas9编辑下慢病毒载体构建成功.HMEC倒置荧光显微镜荧光视野和明视野进行对比,感染可达到80％转染率,GFP持续稳定表达.Western blot结果显示,ATF3蛋白表达有明显下调(P＜0.05).结论:本研究成功构建了ATF3Cas9编辑慢病毒载体,为进一步研究ATF3在静脉桥血管再狭窄中早期内皮功能失调作用机制及基因治疗提供了实验依据.