构建TRAF6基因3'非编码区荧光素酶报告质粒验证及与潜在靶基因TRAF6的靶向关系

背景:前期研究发现miR-146-5p在染氟成骨细胞凋亡时表达上调.目的:构建肿瘤坏死因子受体相关因子6(TNF receptor associated factor 6,TRAF6)基因3'非编码区(3'UTR)荧光素酶报告质粒,利用双荧光素酶报告基因验证miR-146-5p与其潜在靶基因TRAF6的靶向关系.方法:采用生物信息学方法预测miR-146-5p与TRAF6基因的结合位点.采用PCR技术扩增TRAF6基因3'UTR片段,并克隆至pYr-MirTarget载体,构建野生型重组双荧光素酶报告质粒.实验分6组:①6a-5p-核苷类似物+TRAF6野生型3'-UTR共转组;②无核苷类似物对照+TRAF6野生型3'UTR共转组(对照组);③miR-146a-5p-抑制剂+TRAF6野生型;④TRAF6野生型3'-UTR转染组;⑤pYr-MirTarget空质粒转染组;⑥正常细胞组.分别将重组荧光素酶报告质粒与miR-146-5p和核苷类似物共转染Saos-2,同时设置无核苷类似物对照、miR-146-5p抑制剂阴性对照和空载pYr-MirTarget-W3'UTR、TRAF6-W 3'UTR及正常对照.检测6组细胞中荧光素酶活性.将核苷类似物和miR-146-5pinhibitor以及无核苷类似物对照分别转染人成骨细胞Saos-2,裂解细胞提取蛋白后采用免疫印迹检测TRAF6蛋白表达水平.结果与结论:①共转染miR-146-5p mimics的Saos-2细胞中荧光素酶活性为10.1030±0.5585、对照组(无核苷类似物-TRAF63'UTR)荧光素酶活性为13.1400±0.7204、抑制剂(inhibitor)组荧光素酶活性为13.7071±0.4348、野生型TRAF63'UTR质粒的Saos-2细胞中荧光素酶活性为13.2021±0.4565.仅转染空质粒的细胞荧光素梅活性为14.7062±0.4416,Saos-2细胞中荧光素酶活性本底值为1.1264±0.1262.共转染miR-146-5p mimics组明显降低(F=715.789,P<0.0001),其他3组间与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05);②免疫印迹结果显示,与对照组比较,细胞转染miR-146-5p mimics后TRAF6蛋白表达水平明显下调;③结果说明,TRAF6与miR-146-5p存在靶向关系.