类鼻疽伯克霍尔德菌sRNA伴侣蛋白Hfq的表达与纯化

目的 构建重组原核表达质粒,对类鼻疽伯克霍尔德菌分子伴侣Hfq蛋白进行高效表达和纯化. 方法 PCR扩增类鼻疽伯克霍尔德菌hfq基因并克隆至pMD19-T克隆载体中,测序验证后,用Nde I和Xho I双酶切pMD19T-hfq与pET30a(+),将目的基因片段插入含His标签序列的原核表达载体PET30a(+)中,构建重组表达质粒pET30a(+)-hfq,并转化至大肠埃希菌BL21 (DE3),IPTG诱导目的基因表达,采用SDS-PAGE与Western blot对表达蛋白进行鉴定,通过Ni2+螯合柱对目的蛋白进行纯化. 结果 PCR扩增出正确的hfq基因片段,大小为237 bp,与预期值相符.亚克隆质粒与原核表达质粒载体连接后进行双酶切鉴定,重组质粒pET30a(+)-hfq构建正确.重组质粒转化DE3后经IPTG诱导5h,从细菌裂解液中检测到Hfq融合蛋白,分子质量单位(Mr)约为9.4×103.通过Ni2+螯合柱纯化,获得单一SDS-PAGE条带的目的蛋白. 结论 hfq基因原核表达质粒构建成功,Hfq在大肠埃希菌中成功表达,得到Ni2+柱层析获得的高纯度的sRNA伴侣蛋白Hfq,为进一步筛选与该蛋白有相互作用的sRNA及sRNA功能研究奠定了基础.