一段检测锥虫特异性核酸靶序列的筛选及评价

目的 以60S核糖体蛋白L44 (60S RPL44)基因为靶基因,筛选出一段可特异性检测锥虫属(Trypanosoma)原虫的核酸靶序列,并对其敏感度和特异性进行初步评价. 方法 将布氏锥虫指名亚种(T.brucei brucei)的60S RPL44基因序列与公共数据库中田鼠巴贝虫(Babesia microti)、杜氏利什曼原虫(Leishmania donovani)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、恶性疟原虫(P.falciparam)和刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)等24种非锥虫属常见的血源性原虫,以及8种锥虫属内其他种的同源序列进行比对.同时,利用Primer Premier 6对布氏锥虫指名亚种的60S RPLA4基因序列设计多对引物,结合序列比对结果和各引物评价情况,从中筛选出一对评价情况良好且理论上仅能扩增锥虫属靶序列的引物.利用该对引物检测布氏锥虫指名亚种、布氏锥虫罗德西亚种(T.b.rhodesiense)、刚果锥虫(T.congolense)、伊氏锥虫(T.evansi)以及上述5种其他属原虫,评价其特异性.采用梯度稀释(10 ng/μl、1ng/μl、100 pg/μl、10 pg/μl、1 pg/μl)的伊氏锥虫基因组DNA为模板评价其敏感度. 结果 选出一段基于60S RPLA4的特异性序列,针对该序列的扩增引物为P1:5'-CCT-GATGAAAGGTGCAATG-3',P2:5’-CGTTTTCGCCTTCTTGTGGA-3'.该引物扩增布氏锥虫指名亚种、布氏锥虫罗德西亚种、刚果锥虫、伊氏锥虫的DNA均为阳性,扩增片段长156 bp;扩增田鼠巴贝虫、杜氏利什曼原虫、间日疟原虫、恶性疟原虫、刚地弓形虫等非锥虫属原虫均为阴性;该引物检测伊氏锥虫DNA的敏感度为10 pg/μl.结论 筛选获得一段敏感度较高、特异性强的检测锥虫属原虫的核酸靶标序列.