AAV介导NGF过表达载体转染BMSCs对高强度聚焦超声致活体SD大鼠坐骨神经损伤模型保护作用

目的 干细胞是当前研究的热门领域,利用干细胞定向分化作用可以促进神经损伤修复,但是干细胞具有分化方向不定和易老化的特点.本研究探究腺相关病毒(adeno associated virus,AAV)介导神经生长因子(nerve growth factor,NGF)过表达载体转染骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)对高强度聚焦超声致活体SD大鼠坐骨神经损伤模型的保护作用.方法 分离和培养人源BMSCs,采用流式细胞仪检测BMSCs的CD29,CD45和CD90等表面蛋白表达.采用免疫组织化学染色鉴定BMSCs表面CD34和CD44表达.AAV腺病毒构建NGF过表达质粒,通过高强度聚焦超声制备SD大鼠坐骨神经损伤模型,根据处理方式不同,将SD大鼠分成空白对照组,模型组,BMSCs组和NGF过表达组.利用HE染色,电镜方法观察坐骨神经形态,示踪金染色观察神经接头的聚集,TUNEL染色检测细胞凋亡,RT-qPCR检测NGF和caspase-3 mRNA表达.结果 流式细胞仪检测第2代BMSCs表面蛋白,CD29阳性率为98.03％,CD90阳性率为96.92％,CD45阴性率为77.2％,共表达CD29、CD90且CD45表达阴性的细胞数占总细胞数的96.89％.BMSCs细胞表面CD34和CD44免疫组织化学染色呈阳性.慢病毒转染效率＞90％,转染效率较高.HE染色结果中模型组大鼠坐骨神经有明显断裂,BMSCs组大鼠坐骨神经较模型组裂痕缩小,而NGF过表达组断裂处几乎不可见.电镜结果显示,模型组大鼠坐骨神经密度少,且形态不规则,BMSCs组大鼠坐骨神经较模型组密度大,且周边为纤维组织填充,NGF过表达组大鼠坐骨神经密度大,排列较为规则.示踪金染色显示NGF过表达组神经接头处可见神经聚集.RT-qPCR结果显示空白对照组、模型组、BMSCs组和NGF过表达组NGF mRNA相对表达量分别为1.18±0.05、0.77±0.06、1.75±0.07和3.09±0.08,F=9.082,P=0.019;空白对照组、模型组、BMSCs组和NGF过表达组caspase-3 mRNA表达量分别为2.03±0.09、5.05±0.23、3.12±0.09和1.23±0.22,F=9.177,P=0.011.空白对照组、模型组、BMSCs组和NGF过表达组细胞凋亡率分别为(9.34±0.32)％、(31.24±3.43)％、(22.09±2.66)％和(4.97±1.05)％,F=9.664,P=0.014.结论 腺病毒介导NGF过表达质粒转染BMSCs可以促进坐骨神经损伤大鼠坐骨神经修复,其机制可能是通过升高NGF mRNA,降低caspase-3 mRNA水平实现.