GPC3融合蛋白的表达及鉴定

目的 构建人类磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican-3,GPC3)重组真核表达载体,并进行蛋白表达,为后续研究提供基础.方法 以人类肝脏cDNA文库为模板扩增出GPC3基因序列,将扩增产物与pMD-18 simple T载体进行连接构建出T-GPC3克隆载体,用EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ对T-GPC3克隆载体和pcDNA4.1空载体进行双酶切,从T-GPC3克隆载体上获取GPC3基因片段,用T4连接酶将GPC3基因片段连接到pcDNA4.1酶切后的载体上,构建出pcDNA4.1-GPC3真核表达载体;将构建好的载体再次测序,并进行蛋白表达及WB的鉴定.结果 扩增GPC3的PCR产物长度为1 740 bp,质粒测序结果经与NCBI网站比对后序列完全一致,说明pcDNA4.1载体中正确插入了目的片段.Western blotting分析发现有相对分子质量大小约为66 kD的蛋白条带,蛋白经鉴定后亦为GPC3蛋白.结论 成功地构建了真核表达载体pcDNA-GPC3并获得了GPC3蛋白.