携带GFP和FLAG标签的真核表达载体介导细胞珠蛋白在细胞内表达的定位研究

目的 分别构建带有绿色荧光GFP标签和带有FLAG标签的细胞珠蛋白(CYGB)真核表达载体,观察其在人肝星状细胞(LX-2)的表达定位情况,探讨细胞珠蛋白经不同载体介导表达的定位差异.方法 提取人肝癌细胞(HepG2)总RNA,通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)获得CYGB的cDNA,以cDNA为模板采用PCR法扩增得到CYGB编码序列.将其酶切后分别连接至带有GFP标签和FLAG标签的载体上,酶切与测序鉴定阳性克隆.随后将重组质粒分别瞬时转染LX-2细胞,Western blot鉴定表达情况.利用细胞免疫荧光定位,在荧光显微镜下观察两组定位差异.结果 双酶切和测序鉴定表明pEGFP-N1-CYGB和pcDNA3.0-CYGB-FLAG真核表达载体构建成功;经Western blot鉴定,转染的两个载体都能够在LX-2细胞中表达融合蛋白;通过荧光显微镜发现,pEGFP-N1-CYGB和pcDNA3.0-CYGB-FLAG介导的表达产物分别定位在整个细胞和细胞质中.结论 可能由于GFP分子量大等多种原因,导致带GFP标签的融合蛋白定位与带FLAG标签的定位不同,带FLAG标签的融合蛋白定位结果更加可信.