荒漠昆虫小胸鳖甲几丁质酶抗血清的制备及抗体效价检测

目的 几丁质酶是昆虫重要的防御物质,本研究采用DNA-蛋白质联合免疫策略制备荒漠昆虫小胸鳖甲几丁质酶(MpCHI786)的抗血清,用于检测小胸鳖甲在外界不良条件下几丁质酶的变化.方法 从小胸鳖甲成虫中提取总RNA,反转录后RT-PCR扩增Mpchi786 cDNA,构建原核表达载体pET30a-Mpchi786,在大肠杆菌BL21中用IPTG诱导表达获得融合蛋白His-MpCHI786.对融合蛋白切胶纯化后与弗氏佐剂混合作为抗原.另外,构建真核表达质粒pcDNA3.0-Mpchi786,对小鼠尾静脉高压注射,8h后RT-PCR检测其在肝脏的瞬时表达.以pcDNA3.0-Mpchi786肌肉注射免疫小鼠3次后,再用His-MpCHI786融合蛋白加强免疫2次,DNA免疫和免疫结束后收集免疫小鼠的血清,ELISA和Western blot法检测抗血清效价和特异性.结果 RT-PCR结果显示尾静脉高压注射8h后,pcDNA3.0-Mpchi786质粒在小鼠肝脏有特异性表达.Western blot检测表明,用His-MpCHI786融合蛋白作为抗原,pcDNA3.0-Mpchi786DNA质粒免疫3次的抗血清和His-MpCHI786融合蛋白加强免疫2次后的抗血清都显示了特异性反应条带.ELISA检测结果显示抗血清效价高达1∶204 800以上.结论 利用DNA-蛋白质联合免疫法能够获得效价高、特异性的小胸鳖甲几丁质酶MpCHI786的抗血清.