结核分枝杆菌RD区蛋白EspK的表达及对巨噬细胞Ⅰ型干扰素产生的影响

目的:构建结核分枝杆菌Rv3879c基因的原核表达质粒并进行体外表达,研究Rv3879c基因编码蛋白EspK的生物学功能.方法:将Rv3879c基因克隆至原核表达载体pET-28a中,诱导表达后采用亲和层析纯化重组蛋白,经SDS-PAGE和Western Blot鉴定后,用纯化的蛋白免疫小鼠制备血清多克隆抗体,ELISA法检测免疫小鼠的特异性抗体滴度;体外实验检测EspK蛋白对巨噬细胞Ⅰ型干扰素产生的影响;pulldown实验和质谱筛选宿主细胞内与EspK相互作用的蛋白;运用生物信息学软件ProtParam对蛋白进行理化性质和亲疏水性分析,TMHMM和SignalP 5.0 server预测蛋白的跨膜区和信号肽,NPS@SOPMA预测蛋白的二级结构,Scansite 4.0预测蛋白模体结构.结果:成功构建Rv3879c的重组原核表达质粒;SDS-PAGE和Western Blot结果表明,表达产物亲和层析纯化后,获得分子质量为74 kU的EspK蛋白;ELISA检测免疫小鼠血清抗体滴度可达1∶409 600;EspK蛋白能促进小鼠巨噬细胞Ⅰ型干扰素的表达;成功筛选到4种与EspK相互作用的蛋白;生物信息学分析结果显示EspK蛋白为亲水性蛋白,无跨膜区及信号肽结构;EspK的二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲组成,有两个Erk1模体结构,可能参与多种生物学过程.结论:成功表达并纯化出重组蛋白EspK,EspK蛋白可促进巨噬细胞Ⅰ型干扰素的表达,利用生物信息学分析蛋白的结构及性质,为进一步研究EspK蛋白在结核病发生发展中的作用奠定了基础.