结核分枝杆菌早期分泌蛋白MPT64的原核表达及其在结核病血清学诊断上的初步应用

目的 原核表达、纯化结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)早期分泌蛋白MPT64,并初步评估其在结核病(tuberculosis,TB)血清学诊断中的价值.方法 PCR扩增Mtb标准菌株H37Rv mpt64基因,克隆至原核表达载体pET28a(+),构建重组质粒pET28a-mpt64,转化大肠埃希菌BL21(DE3)后,进行重组蛋白的原核诱导表达及纯化.将600 μg纯化的MPT64蛋白经皮下多点免疫新西兰大白兔,隔周免疫1次,共4次,末次免疫2周后,耳缘静脉采血分离血清,ELISA法检测血清效价,Western blot法鉴定抗原特异性.收集44例TB确诊患者(TB组)和36名健康对照人群[HC(heahhy control)组]血清,间接ELISA法检测血清中MPT64抗原的特异性IgG、IgA抗体水平,抗原对照为GroES和Ag85A.结果 重组表达质粒pET28a-mpt64经双酶切鉴定及测序证明构建正确;表达的重组MPT64蛋白主要以包涵体形式存在,部分以可溶性形式存在,经Ni2+-NTA亲和纯化后,纯度可达90％,蛋白浓度约2.0 mg/mL;MPT64兔多克隆抗血清效价达1:2048000,纯化的MPT64蛋白可与其发生反应,在相对分子质量约24000处可见特异性蛋白条带;TB组血清中MPT64抗原特异性IgG和IgA水平均显著高于HC组(P＜0.05),而GroES、Ag85A抗原特异性IgA和IgG水平差异无统计学意义(P＞0.05).结论 重组MPT64蛋白具有较好的血清学诊断效能,可作为TB血清学早期诊断的候选抗原之一.