非洲猪瘟病毒p72蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立非洲猪瘟病毒(ASFV)的血清学检测方法,本研究根据ASFV Georgia2007/1株基因组合成其p72全长基因,并将其克隆至pGEX6p-1载体,构建重组质粒pGEX6p-1-p72并经酶切、PCR和测序鉴定正确后转化BL21感受态细胞,经IPTG诱导表达后经SDS-PAGE和western blot鉴定,结果显示获得了可溶性表达且纯度较高的重组p72蛋白(rp72).利用GST亲和纯化层析柱纯化,得到浓度为0.2 mg/mL的rp72.以rp72作为包被抗原,通过优化各反应条件建立检测猪血清中非洲猪瘟抗体的间接ELISA方法,结果显示,rp72最佳包被浓度为1.25μg/mL,封闭时间为37℃1h;待检血清稀释度为1∶100,孵育时间为37℃30 min;羊抗猪IgG-HRP孵育时间为37℃1h.利用该方法检测280份阴性血清,确定其临界值为0.412.采用建立的间接ELISA抗体方法对PEDV、PRRSV、CSFV、PRV、TGEV、PPV、PCV、E.coli阳性猪血清进行检测,结果显示,除ASFV阳性对照为阳性外,其他病原阳性血清检测结果均为阴性,该方法特异性强;将非洲猪瘟抗体阳性猪血清2倍倍比稀释(1∶100～1∶6400)后,利用该方法进行检测,结果显示其检测阳性血清的稀释度为1∶3200倍时OD450nm值仍大于临界值,敏感性高于市售西班牙ASFV阻断ELISA试剂盒检测结果,本研究建立的方法敏感性较高;对该方法进行批内和批间重复性试验,结果显示批内和批间的变异系数均＜10％,重复性良好.利用本研究建立的ASFV ELISA抗体检测方法(p72)对184份临床血清进行检测,结果显示该方法敏感性为100％,特异性为98.70％;与ASFV阻断ELISA抗体检测试剂盒方法总符合率为98.91％,kappa值为0.961.本研究首次基于rp72建立的非洲猪瘟抗体间接ELISA检测方法具有良好的重复性、敏感性和特异性,为ASFV抗体检测提供了一种快速、精准、经济、高效的方法.