Trolox对猪肌肉干细胞增殖及分化的影响

[目的]探究抗氧化剂-水溶性维生素E的类似物(Trolox)通过调控活性氧对猪肌肉干细胞增殖及分化过程产生的影响,为进一步优化培养肉种子细胞在体外增殖及分化过程提供研究基础.[方法]首先在猪肌肉干细胞增殖过程中,添加不同浓度(0、50、100和200 μmol·L-1)的Trolox培养3 d,利用血细胞计数板进行细胞计数,统计细胞增殖倍数,同时利用CCK8技术检测不同浓度的Trolox对细胞增殖的影响;利用RT-qPCR技术检测不同浓度Trolox处理后表征干性的PAX7表达水平,Western Blotting技术检测PAX7蛋白的表达水平;通过CellROX荧光染料对细胞内活性氧进行染色并通过高通量高内涵活细胞共聚焦成像系统检测Trolox对活性氧的调控作用;进一步在猪肌肉干细胞体外成肌分化进程中添加Trolox处理,利用RT-qPCR技术检测分化早期标志基因MYOG、CAV-3及终末分化标志基因肌球蛋白重链(MyHC)的表达水平,并利用Western Blotting技术检测MyHC蛋白的表达,利用免疫荧光技术对MyHC进行染色并统计MyHC阳性细胞比例.[结果]细胞增殖倍数统计显示,50和100 μmol·L-1的Trolox处理组猪肌肉干细胞增殖倍数显著高于对照组(P＜0.05);CCK8测得50和100 μmol·L-1 Trolox处理组第3天的吸光值显著高于对照组(P＜0.05);100和200 μmol·L-1的Trolox显著上调了PAX7的表达(P＜0.05),对PAX7蛋白的表达有上调趋势,但无显著差异(P＞0.05);添加Trolox后,细胞内活性氧水平被极显著降低(P＜0.001);在分化进程中添加Trolox后,预分化阶段的MYOG和CAV-3及终末分化阶段的MyHC均显著上调(P＜0.05),而Western blotting结果显示MyHC蛋白的表达无显著变化(P＞0.05);免疫荧光结果显示MyHC阳性细胞比例有增多的趋势,但无显著差异(P＞0.05).[结论]Trolox通过降低细胞内的活性氧,促进猪肌肉干细胞的增殖以及分化进程.