EIAV Rev核输出活性检测系统的建立

Rev蛋白是所有慢病毒属成员均具有的附属蛋白,它与病毒mRNA的特定序列结合,将编码病毒结构蛋白的mRNA运输至胞浆,从而促进病毒结构蛋白的表达,将Rev介导病毒mRNA核质运输的生物学功能简称为核输出活性.为建立马传染性贫血病毒(EIAV)附属蛋白Rev的核输出活性检测方法,本研究通过PCR方法克隆了EIAV的结构蛋白Gag-Pol编码区序列及Rev反应元件(RRE)序列,构建pGagpol-RRE表达载体,将其单独或与Rev表达载体(pcDNA-RevFDDV-HA)共转染HEK293T细胞后,通过western blot分析显示,pGagpol-RRE单独转染HEK293T细胞不表达,须在Rev的作用下才能在HEK293T细胞中表达,而且Gag的表达量随着Rev剂量(0.05 μg、0.1μg、0.2μg)的增加而增加.在pcDNA-RevFDDV-HA的基础上,通过PCR方法将Rev核输出活性的关键位点L36突变成A,构建突变的Rev表达载体pcDNA-RevL36A-HA,将其与pGagpol-RRE共转染HEK293T细胞后,经westernblot检测结果显示,未检测到Gag的表达.上述结果表明表达载体pGagpol-RRE可以用于评价EIAV Rev的核输出活性.在此基础上,本研究将不同EIAV的Rev表达载体与pGagPol-RRE共转染HEK293T细胞,经western blot鉴定结果显示,不同EIAV的Rev均可以介导Gag-Pol的表达.上述结果表明,表达载体pGagpol-RRE转染细胞后经western blot检测Gag表达量的变化可以广泛用于评价不同EIAV Rev的核输出活性.本研究利用Rev与RRE结合介导Gag-Pol表达的原理首次建立了 EIAV Rev核输出活性检测系统,为进一步研究Rev的生物学活性奠定了基础.