利用CRSPR/Cas9技术创制抗稻瘟病香型早籼温敏核不育系

[目的]创制新型抗稻瘟病香型早籼温敏核不育系,为高产优质杂交水稻选育提供资源.[方法]利用CRISPP/Cas9技术在水稻稻瘟病基因Pi21、温敏不育基因TMS5和香味基因Badh2的第1外显子处设计靶位点,构建多基因表达载体pC1300-2×35S::gTMS5-gBadh2-gPi21,转化优质常规籼稻品种中早70,测序鉴定分析获得纯合阳性稳定株系.利用稻瘟病喷雾接种和打孔接种方法对稻瘟病基因Pi21的纯合突变株系进行稻瘟病抗性鉴定,利用GC-MS技术对Badh2纯合突变株系的香味物质2-乙酰-1-吡咯啉(2-AP)含量进行测定.[结果]在T0转基因株系中,Pi21、TMS5和Badh2突变频率分别为87.5％、80.0％和87.5％,突变类型多为双等位突变.从T1代中筛选不含载体骨架的纯合突变株系,获得两种三突变纯合株系.稻瘟病接种结果表明,与野生型相比,T2代Pi21纯合变异株系的抗性显著提高.同时,接种后纯合突变体株系内相关防卫基因的表达量显著上调,ROS积累量也显著增加.tms5纯合变异株系表现出典型的温敏不育特性,TMS5基因的表达水平与野生型相比显著降低,高温下UbL404基因的表达水平明显高于野生型.与野生型相比,在Badh2纯合突变体植株中Badh2的表达水平显著下调,并且香味物质2-AP含量极显著增加.[结论]利用CRISPR/Cas9技术成功对Pi21、TMS5和Badh2基因同时进行定向编辑,获得了具有高抗稻瘟病的香型温敏不育系,为高抗、香型不育系材料的选育提供参考,加快高产优质杂交水稻的选育.