多黏菌素类抗生素耐药性编码基因检测用质粒标准样品研制

目的 研制适合多黏菌素类抗生素耐药性编码基因检测用质粒DNA标准样品.方法 由National Center for Biotechnology Information(NCBI)数据库检索得到mcr-1、mcr-3、mcr-5基因参考序列,构建重组质粒和重组菌株;将重组菌传代至15代检测目标基因的遗传稳定性.提取重组质粒,真空干燥,制得标准样品.将标准样品水化、连续10倍梯度稀释,测定聚合酶链式反应(PCR)和实时荧光PCR(RT-qPCR)扩增目标基因的检出限.随机抽取质粒DNA标准样品,采用PCR法和紫外分光光度计法检验样品的均匀性及其在4℃、37℃、-20℃的贮存稳定性.结果 成功获得多黏菌素类抗生素耐药机制编码基因mcr-1、mcr-3、mcr-5基因片段,重组菌15代传代中目的基因遗传稳定.mcr-1、mcr-3、mcr-5标准样品PCR和RT-qPCR最低检出限分别为1.67×104拷贝数/μL 和1.67拷贝数/μL、1.31×106拷贝数/μL和13.1拷贝数/μL、1.55×105拷贝数/μL和1.55拷贝数/μL.T检验表明,各基因随机抽取的12管标准样品质量间的F值均小于F临界值,且PCR均可检出,均匀性符合要求.标准样品在4℃贮存90d、37℃贮存14d、-20℃贮存360 d,定性、定量检验结果稳定、无极显著性差异.结论 本实验制备的mcr-1、mcr-3、mcr-5质粒DNA标准样品目的基因遗传稳定,均匀性和贮存稳定性良好.本研究结果可用于多黏菌素类抗生素耐药机制的快速预测和相关基因检测的质控样品.