BVDV 1型和2型TaqMan双重实时荧光定量PCR检测方法的建立

[目的]建立一种快速检测牛病毒性腹泻病毒1型(BVDV1)和2型(BVDV2)的TaqMan双重实时荧光定量PCR方法.[方法]根据GenBank上收录的95株BVDV1和BVDV2 5'-非编码区设计特异性引物,构建含有BVDV1和BVDV2目的片段的阳性质粒,优化反应条件,构建标准曲线,进行双重实时荧光定量PCR方法的特异性、敏感性和重复性检测,并利用建立的实时荧光定量PCR检测方法对采自吉林省的临床样品进行检测.[结果]建立的双重实时荧光定量PCR方法最适退火温度为57.0℃,最适引物浓度为0.5 μmol/L,最适探针浓度为0.3 μmol/L,BVDV1 和 BVDV2 型的标准曲线分别为:Y=-3.54X+37.36(R2=0.990)和 Y=—3.18X+35.95(R2=0.997).对牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)和牛副流感病毒3型(BPIV3)均无特异性扩增,批内和批间变异系数均＜3％,检测下限为10拷贝/μL.临床样品检测结果显示,总体阳性率为23.1％(36/156),其中BVDV1阳性率为17.9％(28/156),BVDV2阳性率为5.1％(8/156).[结论]本研究建立了可同时快速、准确鉴别BVDV1和BVDV2的TaqMan双重实时荧光定量PCR方法,为BVDV的防控与净化提供技术支撑.