草鱼Pim-1基因克隆、组织表达及多克隆抗体的制备

[目的]旨在进一步研究草鱼(Ctenopharygodon idella)莫洛尼鼠白血病病毒前病毒整合基因1(Proviral integration of moloney murineleukemia virus,Pim-1)的功能.[方法]采用RACE法克隆草鱼Pim-1(CiPim-1)的全长cDNA序列,并对其全长序列进行生物信息学分析.采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测CiPim-1在健康草鱼肝脏、肾脏、头肾、脾脏、肠、心脏、鳃、皮肤、肌肉及血液中的相对表达量,同时将CiPim-1基因(246～318 aa)片段克隆到原核表达质粒pGEX-4T-1中,转入E.coli Rosetta菌株,经IPTG诱导后成功表达重组蛋白pGEX-4T-1-Pim1,随后采用纯化后的融合蛋白免疫新西兰大白兔获得抗血清,并通过ELISA测定抗血清效价,最后采用免疫印迹(Western Blotting)分析抗体的特异性.[结果]CiPim-1基因序列全长1082 bp,编码318个氨基酸,分子量为36.14 ku,具有1个蛋白激酶结构域(Protein kinase domain,35～287 aa).同源性及系统进化结果显示,CiPim-1氨基酸序列与其它鱼类及哺乳类Pim-1均具有较高的相似性和一致性,与斑马鱼(Danio rerio)Pim-1亲缘关系最近.qRT-PCR结果表明,CiPim-1在草鱼血液和组织中均广泛表达,在心脏组织中的相对表达量最丰富,显著高于相对表达量最低的肝脏组织(P>0.05).ELISA与Western blotting结果表明,经抗原亲和纯化后获得的CiPim-1多克隆抗体,效价高,能够特异性识别CiPim-1重组蛋白.[结论]研究克隆了CiPim-1基因,发现该基因在草鱼组织中广泛表达,且成功制备了CiPim-1多克隆抗体,为深入研究CiPim-1在草鱼细胞周期调控、增殖、分化及凋亡等生理过程中的作用奠定了基础.