神经纤维瘤蛋白1在胆囊癌中的机制研究

目的 探讨神经纤维瘤蛋白1(NF1)在胆囊癌中的机制.方法 采用实验研究方法.培养人胆囊癌细胞系GBC-SD、NOZ、SGC996、EH-GB1、ZJU0428,人胚肾细胞系293T,人宫颈癌细胞系HELA;构建免疫共沉淀实验所需的重组质粒mRFP-YAP1FL-FLAG和eGFP-MYC-NF12650～2750-HA,体外纯化Yes相关蛋白1(YAP1)截断体蛋白和NF1融合蛋白.分别采用等温滴定量热实验、GST pull-down实验、免疫共沉淀实验、免疫荧光和激光共聚焦检测NF1与YAP1的体内外相互作用,采用蛋白质免疫印迹法检测不同胆囊癌细胞系中NF1蛋白的表达水平.观察指标:(1)NF1与YAP1的体外相互作用.(2)NF1与YAP1的细胞内相互作用.(3)不同人胆囊癌细胞系中NF1蛋白的表达水平.结合解离常数由ITC200等温滴定量热仪自带软件输出,以(x)±s表示.计数资料以绝对值表示.结果 (1)NF1与YAP1的体外相互作用.①等温滴定量热实验结果显示:PPQY肽段滴定体外纯化YAP1的第1个WW1结构域蛋白存在相互作用,结合解离常数为(0.42±0.06)mmol/L;PPQY肽段滴定体外纯化YAP1的162～275蛋白区段存在相互作用,结合解离常数为(0.69±0.14)mmol/L.②GST pull-down实验结果显示:相对于GST蛋白和His-Sumo-YAP1WW1反应体系,在GST-PPQY融合蛋白与His-Sumo-YAP1WW1反应体系的蛋白泳道中可以观察到目的蛋白His-Sumo-YAP1WW1;相对于GST蛋白和His-Sumo-YAP1WW2反应体系,在GST-PPQY融合蛋白与His-Sumo-YAP1WW2反应体系的蛋白泳道中可以观察到目的蛋白His-Sumo-YAP1WW2.(2)NF1与YAP1的细胞内相互作用.①免疫共沉淀实验结果显示:在使用FLAG凝胶珠孵育共转染mRFP-YAP1FL-FLAG和eGFP-MYC-NF12650～2750-HA的细胞裂解液中,观察到NF1蛋白的免疫印迹.②免疫荧光和激光共聚焦检测结果显示:在人胆囊癌细胞系NOZ的原位荧光中,YAP1和NF1荧光明显,主要定位于细胞质中.在人胆囊癌细胞系SGC996的原位荧光中,YAP1荧光明显,主要定位于细胞核中,NF1荧光不明显.(3)不同人胆囊癌细胞系中NF1蛋白的表达水平.蛋白印迹实验结果显示:以人宫颈癌细胞系HELA中NF1蛋白的表达量为标准,在人胆囊癌细胞系EH-GB1、GBC-SD、NOZ、SGC996、ZJU0428中,NF1蛋白的相对表达量分别为 1.28、0、1.01、0、0.结论 NF1 可能通过直接作用于YAP1蛋白影响胆囊癌.