Notch信号通路对烧伤大鼠血清诱导的肺血管内皮细胞细胞间黏附分子-1的影响

目的:探讨Notch信号通路对烧伤大鼠血清诱导的肺血管内皮细胞(PMVEC)细胞间黏附分子(ICAM)-1的影响。方法:42只SD大鼠(6～8周龄)中，随机选取30只，按随机数字表法分为假伤组(n＝15)和烧伤组(n＝15)，烧伤组大鼠于95 ℃热水浸浴背部18 s造成30%总体表面积Ⅲ度烧伤，假伤组大鼠于37 ℃水浴中浸浴背部18 s模拟致伤。伤后6、12、24、48、72 h，烧伤组随机分别取3只大鼠，腹主动脉采血，酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测血清中ICAM-1含量，假伤组大鼠行相同检测。取剩下的12只大鼠(6～8周龄)中的6只，按前述方法造成30%总体表面积Ⅲ度烧伤，伤后24 h制备烧伤大鼠血清；剩下的6只大鼠不作处理，制备健康大鼠血清。切取10只出生3 d的SD大鼠的肺外边缘组织，组织块法培养大鼠PMVEC，倒置相差显微镜下观察原代细胞培养2、6 d后的形态特征，流式细胞术对原代培养7 d的细胞进行细胞鉴定。取处于对数生长期的第4代PMVEC进行实验，将细胞接种于6孔板中，待细胞生长至80%融合时按随机数字表法分为3组(每组设3个复孔)：对照组(培养液中分别加入体积分数10%健康大鼠血清)，二甲基亚砜(DMSO)+烧伤血清组、γ-分泌酶抑制剂(GSI)+烧伤血清组(分别加入3 μL/mL DMSO、75 μmol/L GSI，培养24 h后，加入体积分数10%烧伤大鼠血清刺激培养24 h)，ELISA法检测PMVEC上清中ICAM-1的含量；流式细胞仪检测各组PMVEC中ICAM-1的含量；采用蛋白质印迹法检测ICAM-1蛋白表达水平，计算相对蛋白表达量；检测PMVEC的细胞黏附能力。数据比较采用单因素方差分析和LSD-t检验。结果:(1)烧伤组大鼠伤后6、12、24、48、72 h血清中的ICAM-1含量分别为(19.77±3.03)、(22.09±3.65)、(22.44±4.04)、(25.40±2.51)、(26.37±3.07) pg/mL，显著高于假伤组的[(10.60±1.51)、(11.03±1.95)、(10.87±0.89)、(9.30±0.89)、(10.93±1.22) pg/mL]，2组比较差异均有统计学意义(t＝4.699、4.466、3.181、10.490、8.097，P<0.05)。(2)原代细胞培养2 d后可见细胞从组织块边缘移出，生长较慢；培养6 d后可见细胞融合，细胞呈铺路石样生长。对原代培养7 d的细胞进行流式细胞术鉴定，结果显示CD31阳性细胞占98.6%，确定为PMVEC。(3)血清刺激培养24 h后，对照组，DMSO+烧伤血清组、GSI+烧伤血清组细胞上清中ICAM-1含量分别为1.21±0.25、2.16±0.12、3.07 ±0.30，3组比较差异有统计学意义(F＝46.72，P<0.05)；与对照组比较，DMSO+烧伤血清组和GSI+烧伤血清组细胞上清中ICAM-1含量均明显增加，差异均有统计学意义(t＝5.977、8.274，P<0.05)；GSI+烧伤血清组细胞上清中ICAM-1含量明显高于DMSO+烧伤血清组，2组比较差异有统计学意义(t＝4.847，P<0.05)。(4)血清刺激培养24 h后，对照组，DMSO+烧伤血清组、GSI+烧伤血清组PMVEC中ICAM-1平均荧光强度分别为2 582±143、3 453±204、4 559±414，3组比较差异有统计学意义(F＝37.84，P<0.05)；与对照组比较，DMSO+烧伤血清组、GSI+烧伤血清组细胞中ICAM-1含量均明显增加，差异均有统计学意义(t＝6.056、7.817，P<0.05)；GSI+烧伤血清组ICAM-1含量明显高于DMSO+烧伤血清组，2组比较差异有统计学意义(t＝4.149，P<0.05)。(5)血清刺激培养24 h后，对照组、DMSO+烧伤血清组、GSI+烧伤血清组的ICAM-1/GAPDH比值分别为0.74±0.08、1.07±0.08、1.38±0.28，3组总体比较差异有统计学意义(F＝30.76，P<0.05); DMSO+烧伤血清组和GSI+烧伤血清组的ICAM-1/GAPDH比值均明显高于对照组，差异均有统计学意义(t＝5.182、6.990，P<0.05)；GSI+烧伤血清组ICAM-1/GAPDH比值明显高于DMSO+烧伤血清组，差异有统计学意义(t＝3.770，P<0.05)。(6)PMVEC与人单核细胞系THP-1细胞共培养2 h后，倒置荧光显微镜下观察对照组、DMSO+烧伤血清组、GSI+烧伤血清组细胞黏附的细胞数呈递增趋势，3组的细胞数分别为(152.00±21.07)、(265.33±36.83)、(345.67±30.66)个，3组比较差异有统计学意义(F＝31.09，P<0.05)；DMSO+烧伤血清组和GSI+烧伤血清组黏附的细胞数均明显高于对照组，比较差异均有统计学意义(t＝4.626、9.016，P<0.05)；GSI+烧伤血清组黏附的细胞数明显高于DMSO+烧伤血清组，差异有统计学意义(t＝2.903，P<0.05)。结论:大鼠烧伤后血清中的ICAM-1含量明显上升，烧伤大鼠血清刺激PMVEC可以导致细胞内ICAM-1含量以及分泌到上清中的ICAM-1含量增加，应用GSI阻断Notch信号通路可以增加ICAM-1的产生及表达，可增加PMVEC对人单核细胞系THP-1细胞的黏附作用。