布鲁氏菌分泌蛋白BspI生物信息学分析及多克隆抗体制备

[目的]试验旨在对布鲁氏菌分泌蛋白BspI进行生物信息学分析,构建原核表达载体,获得BspI蛋白并制备其多克隆抗体,为后续研究该蛋白的生物学功能提供材料.[方法]使用在线软件对BspI蛋白的氨基酸序列进行生物信息学分析,参照布鲁氏菌16M株BspI基因序列(GenBank登录号:DK63_1233)设计引物,PCR扩增目的基因后连接至pMD19-T克隆载体并筛选阳性克隆,将目的基因连接到pET-28a表达载体上,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,加入IPTG诱导蛋白表达,并进行SDS-PAGE分析,用镍柱亲和层析方法纯化蛋白,纯化后的蛋白与弗氏佐剂混合免疫试验兔,采血分离血清,通过Western blotting、间接ELISA法进行多克隆抗体特异性及抗体效价分析.[结果]BspI蛋白为不稳定亲水性蛋白,存在跨膜结构,无信号肽区域,有13个磷酸化位点和7个抗原决定簇,二级结构主要由α-螺旋、延伸链和无规则卷曲组成.PCR成功扩增出675 bp的Bsp I基因,成功构建了 pET-28a-BspI表达载体.SDS-PAGE和Western blotting分析结果表明,成功表达出25.3 ku的蛋白,纯化后无明显杂带,制备的多克隆抗体能够特异性地与BspI蛋白结合.间接ELISA结果显示,BspI蛋白多克隆抗体效价为1 ∶409 600.[结论]制备的兔源BspI蛋白多克隆抗体可以特异性识别BspI蛋白,该蛋白具有较好的反应原性.试验结果为进一步研究BspI蛋白在布鲁氏菌的胞内寄生中发挥的作用提供了参考.