流感疫苗神经氨酸酶含量双抗体夹心ELISA定量检测方法的建立及应用

目的 建立用于定量检测流感疫苗神经氨酸酶(neuraminidase,NA)含量的双抗体夹心ELISA方法,并进行验证.方法 采用多肽合成方式合成NA保守序列,经皮下多点免疫日本大耳白兔和豚鼠,共免疫5次,末次免疫后2周分别经颈动脉和心脏采血,分离血清,通过Protein G/A层析纯化,制备NA通用抗体.以鼠源通用抗体作为包被抗体,兔源通用抗体经HRP标记后作为酶标抗体,建立双抗体夹心ELISA法.确定包被抗体(32、16、8、4、2、1 μg/mL)的工作浓度及酶标抗体(1 ∶ 50～1 ∶ 6 400)的稀释度.验证方法的线性范围、准确度、重复性、中间精密度及耐用性.采用建立的方法测定流感裂解疫苗H1N1、H3N2、BV和BY型单价原液中的NA含量,并与荧光底物法进行比较.结果 兔源和鼠源通用抗体的效价分别为128 000和64 000,纯度分别为95％和96％,蛋白浓度分别为2 339和1 780μg/mL.建立双抗体夹心ELISA法的最佳包被抗体工作浓度为16μg/mL,最佳酶标抗体稀释度为1:400.NA(H3N2型)参考品在20～640 ng/mL浓度范围内与A450呈良好线性关系,R2均＞0.99;500、200、50 ng/mL的NA(H3N2型)参考品的平均样品回收率分别为102.15％、100.89％、100.70％,重复6次检测结果的CV均＜10％,2名实验员3次检测结果的CV均＜15％;不同抗原反应时间及酶标二抗孵育时间的样品回收率为85.41％～103.81％.建立的双抗体夹心ELISA法检测流感裂解疫苗H1N1、H3N2、BV、BY型单价原液NA含量分别为8.06、13.20、6.93、6.18 μg/mL,荧光底物法检测的NA活性分别为29 833、36 800、28 907、25 871 U/L,两者结果呈正相关(R2=0.979 2).结论 建立的NA含量双抗体夹心ELISA定量检测法具有良好的准确度、重复性、中间精密度和耐用性,可用于流感疫苗的检定及生产过程中对NA含量的质量控制.