铜绿假单胞菌二鸟苷酸环化酶SiaD突变体的功能研究

[目的 ]铜绿假单胞菌(Pseudomonas aerugionsa)二鸟苷酸环化酶SiaD调控着铜绿假单胞菌的生物被膜形成等表型.在研究过表达siaD 对生物被膜的调控作用时发现,与野生型siaD基因回补菌株相比,一株回补菌株的生物被膜产量显著升高.本文的目的即是探究该菌株生物被膜产量升高的原因,并对该菌株的其他表型进行研究.[方法]通过测序确定突变位点;利用生物被膜定性和定量实验对发生点突变的菌株表型进行分析;利用 Western blotting实验检测SiaDR119M蛋白表达水平;利用GST-pull down实验检测SiaC蛋白与SiaDR119M蛋白在体外的结合能力;针对siaDR119M点突变基因进行融合蛋白表达载体的构建,表达并纯化该蛋白,利用高效液相色谱检测SiaDR119M的酶活;为了进一步研究c-di-GMP与细菌运动能力的关系,对细菌的运动能力进行检测.[结果]测序比对结果显示,序列的第119个氨基酸发生了突变,由精氨酸突变成了甲硫氨酸.生物被膜定性和定量实验显示,与野生型siaD回补菌株相比,siaDR119M的回补菌株生物被膜产量增加,siaDR119A的回补菌株生物被膜产量低于siaDR119M的回补菌株,siaDR201A回补菌株生物被膜含量显著增加,siaDR119MR201A双突变回补菌株生物被膜的含量低于siaDR201A 回补菌株.Western blotting和GST-pull down实验证明,与野生型SiaD蛋白相比,SiaDR119M蛋白表达水平无差别,SiaC和SiaDR119M蛋白之间存在特异的相互作用.高效液相色谱结果显示SiaDR119M蛋白酶活降低.运动能力检测实验中,与siaD野生型回补菌株相比,siaDR119M回补菌株运动能力减弱,siaDR201A、siaDR119MR201A回补菌株运动能力无差别.[结论]siaDR119M突变导致生物被膜合成增强,酶活降低,运动能力减弱.我们推测突变后表型的变化可能是因为突变在体内会影响SiaD蛋白与下游效应蛋白的相互作用,加强了下游效应蛋白的信号传导能力,然而具体机制有待进一步探索.