番木瓜果糖-2,6-二磷酸酶CpF2KP基因克隆和蛋白表达纯化

番木瓜是岭南四大名果之一,在我国东南部地区广泛种植,因其具有食用和药用双重价值,因此深受人们的青睐.果糖-6-磷酸,2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酯酶(fructose-6-phosphate,2-kinase/frructose-2,6-bisphosphatase,F2KP)是一个独特的双功能酶,具有激酶功能域和酯酶功能域,能催化生物体内糖代谢的重要调节物果糖-2,6-二磷酸(Fru-2,6-P2)的合成和降解.为了研究番木瓜中编码该酶的基因 CpF2KP的功能,得到目的蛋白尤为重要.本研究从番木瓜基因组中提取到CpF2KP基因的编码序列(coding sequence,CDS)序列,该基因CDS全长2 274 bp.将该基因CDS全长扩增之后选用pGEX-4T-l载体进行原核表达.对载体pGEX-4T-1用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ进行双酶切,利用基因重组的方式将扩增序列构建到原核表达载体上.经过诱导条件探索,SDS-PAGE结果显示GST-CpF2KP重组蛋白的大小约为110 kDa,诱导CpF2KP蛋白表达的最适条件为:异丙基 β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside,IPTG)浓度为 0.5 mmol/L,温度 28℃.对诱导后的CpF2KP蛋白进行纯化,得到了纯化的单一目的蛋白.此外,检测了该基因的组织表达特性发现该基因在种子中表达量最高,在果肉中表达量最低.该研究为进一步深入揭示番木瓜CpF2KP蛋白的功能及研究该基因参与的生物学过程提供了重要基础.