牛源化脓隐秘杆菌溶血素的重组表达及其间接ELISA检测方法的建立

为了建立检测牛源化脓隐秘杆菌抗体的间接ELISA检测方法,试验对分离的牛源化脓隐秘杆菌溶血素(pyolysin,PLO)基因序列进行分析,截去信号肽与跨膜区域后进行碱基优化,合成PLO基因片段,连接至原核表达载体pET-30a中,转化至Arctic Express(DE3)大肠杆菌感受态后诱导表达并纯化,以纯化后的重组蛋白作为抗原包被96孔板,建立牛源化脓隐秘杆菌PLO抗体间接ELISA检测方法,确定检测方法的临界值、特异性、敏感性、重复性,并用建立的方法对临床血清样本进行检测.结果表明:成功构建了重组原核表达质粒pET30a-PLO,实现了重组蛋白在Arctic Express(DE3)大肠杆菌感受态中的表达,并建立了用于检测牛源化脓隐秘杆菌PLO抗体的间接ELISA检测方法.该检测方法的临界值为0.354,与常见牛细菌阳性血清无交叉反应,阳性血清稀释至320倍检测仍高于临界值;批内、批间检测变异系数均小于5％;对10份已知阳性血清进行检测,阳性检出率为100％,80份临床牛血清的阳性检出率为21.25％(17/80).说明该方法具有良好的特异性、敏感性、重复性,可用于牛源化脓隐秘杆菌感染的快速检测与流行病学调查.