基于分子信标策略的CRISPR/Cas12a荧光传感器用于循环肿瘤DNA的放大检测

构建了一种以分子信标(Molecular beacon,MB)为信号探针的CRISPR/Cas12a生物传感器,用于循环肿瘤DNA(Circular tumor DNA,ctDNA)的快速放大检测.MB具有良好的稳定性,其颈部末端分别标记有荧光素(FAM)和四甲基罗丹明(TAMRA)两种荧光基团.ctDNA不存在时,CRISPR/Cas12a体系无活性,无法切割MB,因此MB两端的荧光基团由于形成发夹结构的颈部相互靠近而发生荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy transfer,FRET),显示出TAMRA的荧光.当ctDNA存在时,ctDNA特异性识别Cas12a/crRNA二元复合物并激活Cas12a的反式切割活性.由于单链DNA是Cas12a最敏感的底物,因此MB的环部单链首先被切割,继而引起颈部双链的解离而导致两种荧光团彼此远离,无法发生FRET,最终显示出FAM的荧光信号.对MB环部的碱基数目、MB浓度以及crRNA与Cas12a的浓度比例等实验条件进行了优化.在最优条件下,1.7～500 pmol/L范围内,ctDNA浓度与传感器在518 nm处的荧光强度呈线性关系,检出限为0.6 pmol/L(3σ).将此传感器用于血清样品中ctDNA的检测,回收率在93％～110％之间.