炭疽芽抱杆菌PA-LF1融合蛋白的原核表达及其反应原性研究

[目的]构建炭疽芽孢杆菌弱毒株C40-202 PA-LF1融合基因表达载体并对其进行原核表达和反应原性检测,为炭疽亚单位疫苗制备、炭疽诊断和疫苗免疫效果检测提供依据.[方法]根据GenBank中登录的炭疽芽孢杆菌PA和LF基因序列设计2对引物,利用PCR方法从炭疽芽抱杆菌弱毒株C40-202中分别扩增出PA和LF1基因片段,经Xho Ⅰ限制性内切酶消化后,通过黏性末端进行连接,获得PA-LF1融合基因片段,利用SWISS-MODEL 分析软件分别对PA,LF1和PA-LF1融合蛋白进行三级结构预测;将融合基因片段克隆至pET32a(+)质粒中,构建重组质粒pET32a-PA-LF1,并将重组质粒pET32a-PA-LF1转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行诱导表达,SDS-PAGE分析重组蛋白表达,Western blotting鉴定融合蛋白并分析其反应原性.[结果]从炭疽芽抱杆菌弱毒C40-202株成功扩增出PA、LF1和PA-LF1融合基因;成功构建了炭疽芽孢杆菌PA-LF1融合基因表达质粒pET32a-PA-LF1,融合蛋白三级结构预测可折叠为正确的空间构象;构建的重组质粒经诱导表达、纯化和SDS-PAGE,获得分子质量为96 ku的融合蛋白,以包涵体形式表达;经Western blotting验证,纯化后的重组蛋白与经Ⅱ号炭疽芽孢苗免疫后的绵羊血清发生特异性结合,表明其具有良好的反应原性.[结论]PA-LF1融合蛋白具有良好的反应原性,可为炭疽诊断和疫苗免疫效果检测提供理论依据,同时也可作为一种炭疽亚单位疫苗的候选组分.