牦牛lncRNA ENSBGRT00000000387.1慢病毒载体构建及其对卵泡GCs凋亡的影响

旨在构建牦牛lncRNA ENSBGRT00000000387.1过表达慢病毒载体,并将其感染牦牛卵泡颗粒细胞(granulosa cells,GCs),了解它对细胞凋亡的影响.本研究提取牦牛卵泡RNA,以RT-PCR技术扩增lncRNA ENSBGRT00000000387.1全长序列,而后构建其重组质粒,并以慢病毒包装系统(pVSVG∶pMDL∶pRev)包装后利用qPCR法测定在293T细胞上的感染滴度,再感染分离培养的牦牛GCs,以qPCR检测GCs中lncRNA ENSB-GRT00000000387.1的表达水平,并以流式细胞仪检测GCs的凋亡率,以Western blot和qPCR分别检测促凋亡基因CASPASE3、BAX和抑凋亡基因BCL-2的mRNA和蛋白表达水平.结果显示,由牦牛卵泡中成功扩增出lncRNA ENSBGRT00000000387.1的全长2 566 bp序列,将其与LV-EF1a-EGFP-2A载体同源区的片段同源重组,经酶切鉴定及测序验证表明成功构建了重组质粒,将之经慢病毒包装系统包装和浓缩后,在293T细胞的感染效率达(75.77±0.850)％,qPCR测定结果显示该慢病毒滴度为7.32×108 TU·mL-1,表明目的lncRNA过表达慢病毒载体成功构建;以该慢病毒感染牦牛卵泡GCs的感染效率达(52.93±1.168)％,qPCR结果显示感染GCs中目的lncRNA表达水平显著升高(P＜0.01);流式细胞仪检测发现慢病毒感染组细胞凋亡率显著下降(P＜0.01),促凋亡基因CASPASE3和BAX在mRNA和蛋白水平的表达量显著降低(P＜0.01),而抑凋亡基因BCL-2表达量显著升高(P＜0.01).本试验成功构建了lncRNA ENSBGRT00000000387.1慢病毒载体,成功感染牦牛卵泡GCs后发现其具有抑制细胞凋亡的作用,说明其可能在牦牛卵泡功能中发挥作用.