褐飞虱核受体基因NlE75的分子特性和功能分析

[目的]蜕皮激素通过信号级联反应调节昆虫的蜕皮和变态过程,而核受体基因E75是信号通路的早期响应基因.本研究旨在分析褐飞虱Nilaparvata lugens NlE75的分子特性及生物学功能,为褐飞虱的防治和新农药的开发提供新分子靶标.[方法]本研究基于序列比对和同源检索以及褐飞虱转录组数据获得NlE75的cDNA序列,并利用RT-PCR和RACE技术对其进行cDNA克隆;利用生物信息学软件预测分析NlE75编码蛋白的结构特性;利用MEGA5.0邻接法(neighbor-joining,NJ)构建系统进化树.利用RT-qPCR检测NlE75及其转录本在褐飞虱不同发育阶段(卵、1-5龄若虫和成虫)、5龄若虫不同组织(头、胸、腹、表皮、翅芽、脂肪体、中肠和足)中和3龄若虫被注射0.2 μg/头20-羟基蜕皮激素(20-hydroxyecdysone,20E)后的表达谱.通过注射法进行RNAi敲降褐飞虱3龄若虫20E合成关键基因NlCYP314A1后,利用RT-qPCR检测3龄若虫中NlE75的表达量;通过注射法进行RNAi下调3和5龄若虫NlE75及3龄若虫中其转录本的表达后,利用RT-qPCR检测3龄若虫中NlE75及其转录本的表达量,观察敲降NlE75对褐飞虱3和5龄若虫蜕皮和变态的影响,分析NlE75的5个转录本的相互调控关系.[结果]克隆获得褐飞虱NlE75的5个转录本,分别命名为NlE75A,NlE75B,NlE75C,NlE75D和NlE75E(GenBank登录号分别为ON086330,ON086331,ON086332,ON086333和ON086334),其编码蛋白均具有典型的核受体保守结构域;系统进化分析发现其与人体虱Pediculus humanus corporis和德国小蠊Blattella germanica的E75蛋白聚在一起.RT-qPCR结果显示,NlE75基因5个转录本具有不同的发育和组织表达特性;NlE75A和NlE75D的表达量在褐飞虱各发育阶段均较低,NlE75A,NlE75B和NlE75C的表达动态与NlE75 一致,NlE75D在4龄和5龄蜕皮前表达量增至最高,而NlE75E在成虫中的表达量最高;NlE75 5个转录本在5龄若虫各个组织中均有表达,但 NlE75B,NlE75C,NlE75D和 NlE75E在足中高表达,而NlE75A在脂肪体中高表达.20E诱导后4和8 h时,处理组NlE75的表达量较对应的对照组分别上调了 4.7和5.0倍,而RNAi干扰褐飞虱NlCYP314A1后48 h时处理组NlE75的表达量较对照组(注射dsGFP)极显著下调了 47.8％;RNAi结果表明在3龄若虫中注射dsNlE75后导致褐飞虱蜕皮困难,出现畸形虫体;在5龄若虫中注射dsNlE75导致褐飞虱变态终止,出现畸形虫体;3和5龄若虫注射dsNlE75均无法完成蜕皮过程并最终100％死亡.只有对5个转录本均干扰后才出现畸形表型,而对单一转录本干扰后则不出现畸形表型,说明NlE75基因5个转录本之间存在着复杂的调控关系.[结论]褐飞虱中NlE75基因具有5个转录本,具有不同的发育和组织表达特性;RNAi结果表明,NlE75基因5个转录本存在明显的功能冗余现象,NlE75基因在褐飞虱蜕皮过程发挥重要作用.