基于无性期18S rDNA特异性引物检测5种疟原虫qPCR的建立和应用

目的 建立基于疟原虫无性期(A期)18S rDNA检测感染人的5种疟原虫的qPCR,并评价其检测效果.方法 从GenBank中下载5种疟原虫A期、子饱子期(S期)、卵囊期(O期)和人的18S rDNA序列进行比对,划分保守区和变异区,在保守区设计疟原虫属特异性引物,在变异区设计种特异性引物.以5种疟原虫DNA、田鼠巴贝虫和婴儿利什曼原虫DNA为模板进行qPCR扩增,筛选特异性引物对.应用qPCR法筛选特异性引物对的最佳退火延伸温度和引物浓度.分别构建5种原虫A期18S rDNA短片段(筛选出的引物对扩增产物)和长片段(属特异性引物扩增产物)质粒,以连续浓度梯度的短片段质粒DNA[(5×101)～(5×108)拷贝/μl]、长片段质粒DNA[(5×104)～(5×109)拷贝/μl]为模板分别进行qPCR扩增,测定筛选出的引物对的扩增效率、最低检出限[包括最低质粒浓度、循环数阈值(Ct值)、变异系数]、无扩增时非目标DNA的最高浓度、可检出的混合DNA中不同虫种间的最大拷贝浓度比值.以5倍稀释的18份疟原虫血样DNA[恶性疟原虫(Pf)6份、间日疟原虫(Pv)6份、卵形疟原虫(Po)4份、三日疟原虫(Pm)2份、诺氏疟原虫(Pk)1份]为模板,应用筛选出的特异性引物分别进行qPCR、一步反转录qPCR和巢式PCR扩增,计算最低检出限时的原虫密度.用筛选出的特异性引物进行应用验证,对70份疟疾患者血样DNA(Pf 26份、Pv 14份、Pm 14份、Po 9份、Pk 3份、混合感染4份)、65份疟原虫阴性人血样DNA以及阿米巴(1份)、田鼠巴贝虫(1份)和杜氏利什曼原虫DNA(3份)进行qPCR扩增,以样品提供者的检测结果为标准,计算qPCR检测的敏感度、特异度、符合率.不同PCR方法检测结果的比较采用卡方检验、t检验、Mann-Whitney检验或Wilcoxon秩和检验.结果 序列比对结果显示,5种疟原虫A期18S rDNA序列的一致性为89.3％-96.7％,高于S期的60.0％-92.1％,可分为9个保守区和8个变异区.除Pv O期和Pm S期18S rDNA外,保守区序列长度相同,一致性≥92％.筛选获得1对属特异性引物和5对种特异性引物,各引物对的qPCR扩增效率为90.6％-98.8％,qPCR扩增的最佳退火延伸温度为57.8℃,最佳引物终浓度为0.3p.mol/L.6对特异性引物的qPCR检出的最低质粒浓度均为5×102拷贝/μl,对应Ct值为32.3-33.1,变异系数为0.5％-3.7％.5对种特异性引物qPCR扩增非目标DNA结果均为阴性时非目标DNA的最高浓度为(5 x 106)～(5×108)拷贝/μl,可检出的混合质粒中不同虫种间的最大拷贝浓度比值均为104.一步反转录qPCR、qPCR和巢式PCR可检出的最低原虫密度平均值分别为(4.1±5.1)、(6.0±4.3)和(8.2±2.9)虫/μl血,最低值分别为0.01、0.3和2.0虫/μl血,变异系数分别为125.6％、72.2％和35.8％,一步反转录qPCR检出最低原虫密度的敏感性高于另两种方法(Wilcoxon秩和检验,Z=-2.0、-2.0,均P＜0.05),qPCR和巢式PCR的敏感性差异无统计学意义(t=-1.7,P＞0.05).应用验证结果显示,qPCR的敏感度和特异度均为98.6％,qPCR检测结果与标准结果的符合率为98.6％,差异无统计学意义(x2=0.0,P＞0.05).结论 建立了基于疟原虫A期18S rDNA的qPCR检测系统,可用于鉴定常规疟疾血样.