甲基丁香酚保护胰岛细胞免受缺氧/复氧损伤的作用机制研究

目的:探讨甲基丁香酚对胰岛缺血/再灌注损伤的保护作用及其可能机制。方法:选取6~8周雄性BALB/c小鼠分离纯化胰岛，将其分为正常对照(Normal)组(普通培养，不予任何处理)、缺氧/复氧(H/R)组(予H/R处理)、H/R+二甲基亚砜(DMSO)组[予二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)和H/R处理]；H/R+甲基丁香酚(Me)组(予以甲基丁香酚和H/R处理)。使用吖啶橙/碘化丙啶双染，对每组胰岛细胞进行活力检测，酶联免疫吸附法(ELISA)测定胰岛细胞功能，即胰岛素分泌情况。选取小鼠的胰岛β细胞系Min6细胞，通过CCK8检测甲基丁香酚在不同的浓度梯度下对正常培养和经H/R处理后的胰岛细胞的增殖活性影响。再将Min6细胞按照处理方式不同分为正常对照(Normal)组、缺氧/复氧(H/R)组、H/R+二甲基亚砜(DMSO)组和H/R+甲基丁香酚(Me)组，分组定义同小鼠原代胰岛。通过流式细胞术和Hoechst 33342核染色检测各组Min6细胞凋亡率，Western blot检测各组p-JNK、p-p38、JNK、p38、Bcl-2、Bax等蛋白的表达情况。所得数据用单因素ANOVA或 t检验进行统计学分析。 结果:H/R组原代胰岛细胞死亡细胞占比为(29.47±2.65)%，较Normal组的(7.63±1.53)%明显上升，组间差异有统计学意义( P<0.001)。H/R+Me组胰岛死亡细胞占比为(20.63±3.07)%，较H/R组和H/R+DMSO组的(29.47±2.65)%和(30.13±1.50)%下降，组间比较，差异均有统计学意义( P<0.05和 P<0.01)。在高糖刺激下，H/R+Me组胰岛的胰岛素分泌水平为(1.76±0.08)mg/L，较H/R组和H/R+DMSO组的(1.24±0.14)mg/L和(1.27±0.05)mg/L上升，差异均有统计学意义( P<0.01)。正常的Min6细胞经甲基丁香酚处理后，在一定浓度范围(0~40 μmol/L)内，对细胞的活性无明显影响。经H/R处理的Min6细胞，予甲基丁香酚(5 μmol/L)后，细胞活性较未添加甲基丁香酚组增加(1.19±0.03和1.00±0)，差异有统计学意义( P<0.01)。与H/R组和H/R+DMSO组相比，H/R+Me组细胞的总凋亡率下降(Hoechst 33342染色：14.50%±1.05%和23.30%±1.18%，14.50%±1.05%和22.77±1.75%， P值均<0.001；流式细胞术：4.36%±0.54%和21.44%±1.02%，4.36%±0.54%和21.68%±3.06%， P值均<0.01)，p-JNK和p-p38表达受到抑制(p-JNK：0.77±0.06和1.03±0.05，0.77±0.06和0.93±0.04， P值均<0.001；p-p38：0.80±0.05和1.01±0.08，0.80±0.05和1.00±0.05， P值均<0.05)，Bcl-2/Bax比值升高(1.62±0.13和0.72±0.10，1.62±0.13和0.74±0.13， P值均<0.01)。 结论:甲基丁香酚可改善经H/R的胰岛活力和功能，并抑制经H/R的Min6细胞的凋亡，其机制可能与JNK和p38 MAPK信号通路相关。