Untersuchung der Bengalrosa photodynamischen Therapie auf die Viabilität und Proliferation humaner keratolimbaler Epithel- und Stromazellen, in vitro

ZUSAMMENFASSUNG Ziel: Die photodynamische Therapie kann eine alternative Behandlungsmethode bei antibiotikaresistenten Keratitiden darstellen. In dieser Studie wurde die Wirkung der photodynamischen Therapie mit Bengalrosa (RB-PDT) auf die Viabilität und Proliferation von humanen limbalen Epithelstammzellen (T-LSCs), humanen Hornhautepithelzellen (HCE-T), limbalen Fibroblasten (LFCs), normalen und Keratokonus-Fibroblasten (HCFs und KC-HCFs) „in vitro“ untersucht. Material und Methoden: Für die Experimente an den limbalen Epithelstammzellen wurden 2 verschiedene Zelllinien (T-LSCs und HCE-T) verwendet. Die primären LFCs und HCFs wurden aus den Korneoskleralringen von Hornhautspendern, die KC-HCFs aus perforierenden Keratoplastiken von Keratokonus-Patienten isoliert und kultiviert (jeweils n=5). Die RB-PDT wurde mit einer 0,001% igen RB-Konzentration bei einer Wellenlänge von 565 nm und einer Energiedosis von 0,14 bis 0,7 J/cm2 durchgeführt. Zur Bestimmung der Viabilität wurde 24 Stunden nach der Bestrahlung der XTT-, zur Bestimmung der Proliferation der BrdU-Assay verwendet. Ergebnisse: Die ausschließliche Verwendung von RB oder Bestrahlung hatten keinen messbaren Einfluss auf die Viabilität oder Proliferation der unterschiedlichen Zelltypen (p≥0,1). Unter Verwendung der RB-PDT mit einer Dosis von 0,17 J/cm2 sank die Viabilität jedoch in den HCFs (p < 0,001) und KC-HCFs (p < 0,0001), und bei einer Dosis von 0,35 J/cm2 in den T-LSCs (p < 0,001), HCE -T (p < 0,05) und LFCs (p < 0,0001). Die Zellproliferation verringerte sich signifikant ab einer Dosis von 0,14 J/cm2 in T-LSCs (p < 0,0001), HCE-T (p < 0,05) und KC- HCFs (p < 0,001) und ab einer Dosis von 0,17 J/cm2 Fluenz in HCFs (p < 0,05). Für die Proliferationsbestimmung der LFCs konnten mit dem BrdU-Assay keine Werte ermittelt werden. Schlussfolgerung: Die RB-PDT zeigt eine dosisabhängige Phototoxizität auf Hornhautepithel- und Stromazellen. Die in dieser Studie ermittelten Daten und experimentellen Parameter bieten eine verlässliche Referenz für zukünftige Untersuchungen für die photodynamische Therapie mit Bengalrosa. Abstract Purpose: To investigate the effect of Rose Bengal photodynamic therapy (RB-PDT) on viability and proliferation of human limbal epithelial stem cells (T-LSCs), human corneal epithelial cells (HCE-T), human limbal fibroblasts (LFCs), human normal and keratoconus fibroblasts (HCFs and KC-HCFs), in vitro. Methods: T-LSCs and HCE-T cell lines were used in this research. LFCs were isolated from healthy donor corneal limbus (n=5), HCFs from healthy human donor corneas (n=5), and KC-HCFs from penetrating keratoplasties of keratoconus patients (n=5). After cell culture, RB-PDT was performed using 0.001% RB concentration and 565 nm wavelength illumination, with 0.14 to 0.7 J/cm2 fluence. The XTT and the BrdU assays were used to assess cell viability and proliferation, 24 hours after RB-PDT. Results: Rose Bengal or illumination alone did not change cell viability or proliferation in any of the cell types (p≥0.1). However, following RB-PDT, viability decreased significantly from 0.17 J/cm2 fluence in HCFs (p<0.001) and KC-HCFs (p<0.0001), from 0.35 J/cm2 fluence in T-LSCs (p<0.001), HCE-T (p<0.05) and LFCs ((p<0.0001), respectively. Cell proliferation decreased significantly from 0.14 J/cm2 fluence in T-LSCs (p<0.0001), HCE-T (p<0.05), and KC-HCFs (p<0.001) and from 0.17 J/cm2 fluence in HCFs (p<0.05). Regarding LFCs proliferation, no values could be determined by the BrdU assay. Conclusions: Though RB-PDT seems to be a safe and effective treatment method in vivo, its dose-dependent phototoxicity on corneal epithelial and stromal cells has to be respected. The data and the experimental parameters applied in this study may provide a reliable reference for future investigations.