MCDA-LFB检测肺炎克雷伯菌的最佳扩增温度、最佳扩增时间选择及评估

目的 筛选多交叉置换扩增技术(MCDA)结合纳米生物传感条(LFB)检测肺炎克雷伯菌的最佳扩增温度、最佳扩增时间,并对MCDA-LFB法检测肺炎克雷伯菌的效果进行评估.方法 根据肺炎克雷伯菌特异的保守基因rcsA的核苷酸序列,采用Primer Premier Version 5.0软件设计一套特异性MCDA引物,其中交叉引物CP1和扩增引物C1分别标记异硫氰酸荧光素(FITC)和地高辛(Dig),建立25μL的MCDA反应体系.将温度按60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃依次递增,分别扩增1 h,然后85℃加热5 min后终止反应,使用实时浊度仪观察DNA浓度曲线,绘制MCDA扩增反应动力学图,确定最佳扩增温度.在筛选出的最佳扩增温度下,选择10 min、20 min、30 min和40 min 4个时间点分别对10 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、100 fg/μL、10 fg/μL和1 fg/μL的肺炎克雷伯菌DNA进行MCDA扩增,使用LFB进行检测,根据LFB检测结果确定最佳扩增时间.使用MCDA-LFB法检测36株肺炎克雷伯菌和18株非肺炎克雷伯菌,使用临床分离培养法和MCDA-LFB法检测呼吸道感染患者的42份痰液样本和3份健康对照痰液样本,观察MCDA-LFB法检测肺炎克雷伯菌的灵敏度、特异度.将肺炎克雷伯菌ATCC700603标准株基因组DNA分别稀释至10 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、100 fg/μL、10 fg/μL和1 fg/μL,使用MCDA-LFB法检测,依据结果是否阳性判定检测下限.结果 MCDA-LFB检测肺炎克雷伯菌的最佳扩增温度为63℃,最佳扩增时间为30 min.MCDA-LFB法检测肺炎克雷伯菌的灵敏度、特异度均为100％.MCDA-LFB检测肺炎克雷伯菌的检测下限为100 fg/μL.结论 MCDA-LFB检测肺炎克雷伯菌的最佳扩增温度为63℃,最佳扩增时间为30 min.MCDA-LFB检测肺炎克雷伯菌的方法简单、快速、特异、灵敏,可以用于临床呼吸道标本中的肺炎克雷伯菌早期筛选.