瑞芬太尼诱导的SH-SY5Y细胞中PKCε与MOR相互作用的研究

目的 利用人神经母瘤细胞(SH-SY5Y),探讨瑞芬太尼对蛋白激酶Cε(PKCε)和μ阿片受体(MOR)之间相互作用的影响以及PKCε对瑞芬太尼诱导MOR内化的调节作用.方法 设置对照组和瑞芬太尼处理组(R2h组),R2 h组采用10 μmol/L瑞芬太尼处理SH-SY5Y细胞2 h.采用细胞免疫荧光观察MOR蛋白分布变化,免疫印迹检测MOR蛋白膜浆组分表达变化;细胞免疫荧光检测PKCε与MOR共定位情况,免疫共沉淀检测瑞芬太尼作用不同时间后PKCε与MOR相互作用变化;构建PKCε、MOR及PKCε截短蛋白的原核表达载体并诱导表达和纯化蛋白,采用pull-down实验检测两者直接相互作用情况.分别通过PKCε特异性激动剂和抑制剂预处理,观察激活或抑制PKCε后对瑞芬太尼诱导MOR内化的影响.结果 免疫荧光结果显示,与对照组比较,R2h组MOR显著内化[(0.72±0.07)vs.(12.57±1.10)],差异有统计学意义(t=8.90,P＜0.000 1).免疫印迹结果显示,胞膜MOR蛋白显著减少,胞浆组分MOR蛋白增加.细胞免疫荧光共染显示,SH-SY5Y细胞中的PKCε与MOR存在共定位,而免疫共沉淀结果表明瑞芬太尼可增强PKCε和MOR的相互作用.GST pull-down结果显示,PKCε与MOR有直接相互作用,且主要结合区域是PKCε的催化区域.与R2h组比较,PKCε特异性抑制剂预孵育30min显著减少瑞芬太尼诱导的 MOR 内化[(1.00±0.05)vs.(0.76±0.03)],而激动剂处理则促进 MOR 的内化[(1.00±0.05)vs.(1.21±0.06)],差异有统计学意义(F=22.80,P＜0.05).蛋白免疫印迹结果进一步显示,εv1-2抑制MOR膜蛋白的下调(F=31.54,P＜0.05)和浆蛋白的增加(F=28.25,P＜0.05),而DCPLA则作用相反.结论PKC ε通过与MOR直接相互作用调节瑞芬太尼诱导的SH-SY5Y细胞中的MOR内化,为瑞芬太尼诱导MOR内化机制提供新的科学依据,对寻求防治阿片类药物副作用靶点具有潜在的临床意义.