基于环介导等温扩增技术及规则成簇间隔短回文重复序列的日本血吸虫核酸检测方法的建立及评价

目的 建立一种灵敏、特异的基于环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)-规则成簇的间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)的日本血吸虫核酸检测方法.方法 以日本血吸虫SjR2基因片段作为靶序列,设计LAMP引物、gRNA和ssDNA探针,建立并优化LAMP-CRISPR反应体系.用LAMP-CRISPR方法检测含有SjR2靶序列的10倍梯度稀释的重组质粒,不同发育阶段日本血吸虫基因组DNA,以及肝片形吸虫、曼氏血吸虫、肥胖带绦虫、华支睾吸虫、似蚓蛔线虫、美洲钩口线虫、卫氏并殖吸虫、细粒棘球绦虫等蠕虫基因组DNA,评价其灵敏度和特异度.用LAMP-CRISPR方法分别检测15份血吸虫感染的阳性钉螺样本以及30份未感染的阴性钉螺样本,并与LAMP检测结果比较,以评价LAMP-CRISPR方法用于筛查感染性钉螺的应用效果.结果 建立的基于LAMP-CRISPR的核酸检测方法可特异性扩增并检测出日本血吸虫目的基因片段.其最适反应温度为37℃,反应体系中gRNA的最佳反应浓度为40 nmol/L,Cas12a蛋白的最佳反应浓度为40 nmol/L.该方法与肝片形吸虫等蠕虫基因组DNA均无交叉反应;以 10 倍梯度稀释的重组质粒为模板,该方法检测限为10拷贝/μL;此外,该方法能够准确检测出日本血吸虫虫卵、毛蚴、胞蚴、尾蚴、童虫及成虫基因组DNA.45份钉螺样本检测结果显示,LAMP-CRISPR与LAMP检测感染性钉螺的结果差异无统计学意义(χ2=0.05,P>0.05);与金标准比较,LAMP-CRISPR方法的灵敏度为100.00%(15/15),特异度为96.67%(29/30),LAMP方法的灵敏度为100.00%(15/15),特异度为93.33%(28/30).结论 本研究建立了一种灵敏性和特异性均较高的基于LAMP-CRISPR的日本血吸虫核酸检测方法,具有用于日本血吸虫感染快速检测及风险监测的潜力.