Diagnostic et suivi des leucémies aiguës lymphoblastiques (LAL) par séquençage haut-débit (HTS)

Le diagnostic moleculaire des LAL permet, par la recherche de rearrangements V (D) J sur l’ADN des lymphoblastes, de mettre en evidence des marqueurs de clonalite dans 95% des cas. Ces marqueurs servent aussi a quantifier la maladie residuelle par Q-PCR en temps reel (chimie Taqman) afin d’adapter au mieux la therapeutique. Cette strategie peut echouer dans les cas suivants : absence de marqueur initial, echec du sequencage ou enfin emergence a la rechute d’un clone non observe au diagnostic ou tres minoritaire. Le HTS autorise desormais le sequencage profond d'une population lymphoide et permet de contourner ces ecueils. Ce travail explore l'utilisation de cette technologie pour le diagnostic et le suivi des LAL. La clonalite de 8 patients pediatriques (5 LAL-B et 3 LAL-T, 2F/6M, 2 a 14 ans), au diagnostic et en suivi (37 points) a ete etudiee . La sensibilite a ete evaluee par une gamme de dilution d’ADN tumoral en ADN de PBL (de 10-2 a 10-5). Pour chaque echantillon, 500ng d’ADN medullaire sont extraits sur colonne Qiagen®, doses sur NanoDrop® et amplifies par les systemes de PCR classiques, non fluorescents pour la cible TCRg et les IgH, systemes decrits ou derives des travaux du Biomed-2. Les librairies de sequencages sont realisees a partir des produits de PCR verifies sur gel d’agarose puis barre-codees et sequencees avec un sequenceur Ion Torrent (puce 318). Les sequences obtenues sont classees sur la base de leur rearrangement V (D) J par le logiciel Vidjil dedie (http : //bioinfo.lifl.fr/vidjil). Nous avons identifie les clones et leurs proportions respectives au diagnostic, et etudie leur evolution aux differents points de suivi. Nous avons retrouve les clones detectes par les methodes classiques mais aussi mis en evidence des clones minoritaires. Les rechutes ont ete retrouvees, et, pour un patient, un clone emergent a ete observe. L'ensemble de l'analyse validee, incluant la preparation, le sequencage et l'analyse informatique, semble plus rapide que par les protocoles actuels. Par la reconstruction de repertoires lymphoides, le HTS prefigure des avancees dans la connaissance des pathologies lymphomateuses et auto-immunes. Notre objectif est d’integrer cette technologie dans le processus moleculaire de diagnostic et de suivi des LAL, ce qui pose aussi des defis de formation a l’analyse et l’interpretation des resultats et de praticite au sein d'un laboratoire d'hematologie. Le sequencage haut-debit, couple a une analyse bioinformatique, donne une cartographie plus complete de la population blastique au diagnostic d’une LAL et permet d'observer l’evolution de cette population.