VvmiR396及其靶基因VvGRF1在葡萄种子发育过程中的表达分析

[目的]本文旨在鉴定葡萄miR396 家族成员(VvmiR396)及其靶基因VvGRF1,探究VvmiR396-VvGRF1 在种子败育/发育中的作用模式.[方法]通过miR-RACE、RLM-RACE、PPM-RACE、烟草共转化活体验证等方法鉴定VvmiR396 及其靶基因,利用生物信息学分析其潜在功能与进化保守性,利用RT-qPCR方法检测VvmiR396 在有核和无核品种中的时空表达差异及VvmiR396-VvGRF1 相关性差异.[结果]与葡萄品种'魏可'相比,'京可晶'花后 28d时种子发育被严重抑制,出现败育且种子萎缩,而'魏可'种子正常发育.对VvmiR396a、VvmiR396b、VvmiR396c、VvmiR396d的前体及其成熟体序列进行鉴定,其前体均可形成典型的茎环结构,成熟体序列均位于茎环的 5'臂上.VvmiR396 与烟草、番茄等物种的同源序列亲缘关系较近,而与小麦的亲缘关系较远.预测到VvmiR396 的 8 条潜在靶基因,利用RLM-RACE、PPM-RACE技术体外鉴定到VvGRF1和VvGRF10是VvmiR396的真实靶基因,且VvmiR396对VvGRF1 的裂解位点及频度为 10th(19/22、5/25)/11th(2/22、2/25),对VvGRF10 的裂解位点及频度为 9th(17/21、3/20)/11th(2/21、1/20);进一步利用烟草共转化体系对它们的裂解作用进行活体验证,发现VvmiR396 对VvGRF1 的裂解作用强于VvGRF10.同源保守性分析发现:VvGRF1 与胡杨、毛白杨、荷花、烟草等物种的亲缘关系较近,且不同物种的GRF1 蛋白均含有QLQ、WRC两个结构域;VvMIR396(VvmiR396 的前体基因)和VvGRF1 的启动子上都有多种激素(生长素、赤霉素、脱落酸等)响应元件.定量结果表明:在'京可晶'种子败育过程中,VvmiR396 的表达量逐渐升高,且在败育关键期(花后 42 d)表达量最高,而VvGRF1 呈现相反表达模式;在有核品种'魏可'种子发育中,VvmiR396 表达量呈下降趋势,在花后 42d表达量最低,靶基因的表达模式相反,表明VvmiR396 可能介导VvGRF1 正调控葡萄种子败育,而负调控种子的发育.进一步相关性分析发现,'京可晶'种子败育中VvmiR396b与VvGRF1的负相关性最高.[结论]在假单性结实葡萄'京可晶'中,鉴定到VvmiR396a、VvmiR396b、VvmiR396c、VvmiR396d共4 个成员;VvmiR396b-VvGRF1 可能是参与调控葡萄种胚败育的重要模块.