Tn5转座酶融合蛋白在CUT&Tag实验中的优化及评价

Tn5是一种细菌转座子.经改造的Tn5能够高效地切割DNA,同时连接上特定的接头序列,因而广泛应用于高通量二代测序文库构建中.CUT&Tag(Cleavage Under Target & Tagmentation)是一种改进的研究蛋白质与DNA互作的技术,具有重复性好、信噪比高及操作简便等优点.该技术采用pA(Protein A)或pG(Protein G)与Tn5形成融合蛋白,定位于特定抗体(用于识别目标蛋白),利用Tn5的特性,在目标位点附近打断DNA的同时引入测序接头,随后提取DNA,再进行PCR扩增即可获得测序文库.但不同类型的抗体与pA或pG的亲和力不同,因此限制了部分抗体在CUT&Tag技术中的应用.为克服这一局限,该文构建了pG与Tn5的融合蛋白表达载体,通过原核表达及亲和纯化的方式获得pG-Tn5重组蛋白;并以RNA聚合酶Ⅱ(Pol Ⅱ)特异性抗体Pol Ⅱ Ser5P(小鼠lgG1型抗体和兔IgG型抗体)为例,在模式植物拟南芥(Arabidoopsis thaliana)中评估pA-Tn5与pG-Tn5在不同类型抗体的CUT&Tag测序文库构建中的效果.结果表明,lgG1型抗体与pG-Tn5的亲和力更高,构建的文库质量更好,而IgG型抗体与2种酶的亲和力相当;同时,较低起始量的植物材料也能获得较好的效果,证明了CUT&Tag的应用优势.该研究优化了CUT&Tag技术,可为后续CUT&Tag实验中针对不同抗体时Tn5融合蛋白的选择提供参考.