家兔ANXA1蛋白与猪瘟病毒E2蛋白相互作用并影响其复制的研究

本研究团队前期研究发现,猪瘟病毒(CSFV)HCLV株E2蛋白结构域Ⅰ(E2Domain 1)是HCLV株适应家兔的关键结构域,Domain I中108位脯氨酸(P)和109位苏氨酸(T)是HCLV株适应家兔必需氨基酸.为进一步探究HCLV适应家兔的分子机制,本研究提取家兔脾脏淋巴细胞膜蛋白分别与CSFV Shimen(SM)株E2蛋白(SME2)、HCLV株E2蛋白突变体(HCLV E2P108L-T1091)及HCLV株E2蛋白(HCLV E2)共孵育,经SDS-PAGE后通过蛋白质质谱鉴定,结果却意外发现,CSFVSME2与家兔脾脏淋巴细胞膜蛋白作用后在37 ku左右处多出一条带;质谱分析结果显示其可能为细胞膜蛋白膜联蛋白1(ANXA1),且与CSFVSME2蛋白之间可能存在相互作用.为了分析ANXA1在HCLV适应家兔中的作用,将CSFV SM株和HCLV株分别接种家兔,48 h和72 h后分离各组兔外周血单个核淋巴细胞(PBMC),采用RT-qPCR方法检测ANXA1基因mRNA的转录水平.结果显示,与对照组相比,家兔在接种SM株和HCLV株后,ANXA1基因mRNA转录水平均显著(P＜0.05)或者极显著(P＜0.01)下调,且与接种HCLV株的家兔相比,接种SM株家兔中ANXA1基因mRNA的转录水平极显著(P＜0.001,72 h)或者显著(P＜0.05,48 h)下调,表明接种SM株后的家兔可能通过调控ANXA1的转录水平抑制SM株的复制.将pCAGGS-Flag-ANXA1和pCAGGS-Flag分别转染HKE293T细胞,48 h后收集细胞样品,通过GST pulldown验证ANXA1与CSFV SM E2蛋白的相互作用;将pCAGGS-Strep-SME2+pCAGGS-Flag-ANXA1 共转染 HEK293T 细胞作为强毒实验组,将 pCAGGS-Myc-HCLV E2+pCAGGS-Flag-ANXA1共转染HEK293T细胞作为弱毒实验组,48 h后采用Co-IP试验验证ANXA1与不同CSFV E2的相互作用.上述结果进一步表明,ANXA1与CSFV SM E2存在相互作用,但其与HCLV E2无相互作用;将pCAGGS-Strep-SME2+pCAGGS-Flag-ANXA1共转染HEK293T细胞作为实验组,采用激光共聚焦显微镜观察发现SM E2蛋白和ANXA1蛋白共定位于细胞浆中.将表达ANXA1的重组质粒转染ST细胞,48 h后分别接种CSFV SM株和HCLV株,采用RT-qPCR检测CSFV基因的拷贝数.结果显示,与转染pCAGGS-Flag的ST细胞相比,接种CSFV SM株的细胞中病毒基因拷贝数极显著上升(P＜0.01),而接种HCLV株细胞中病毒基因拷贝数无明显变化.表明过表达ANXA1后可以促进CSFV强毒株的复制,但不影响弱毒株的复制.本研究首次证实,家兔脾脏淋巴细胞ANXA1通过与CSFV SME2蛋白的相互作用促进CSFV的复制,为进一步研究CSFV E2蛋白的功能奠定了基础.