鸡新城疫病毒RT-TaqMan-LAMP检测方法的建立及应用

[背景]新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)的传染可能会引发作为二类传染病之一的新城疫(Newcastle disease,ND),给养禽业带来巨大的经济损失,因而早期、精准的 NDV 筛查是防治 ND 暴发的关键.[目的]针对新城疫病毒(NDV)建立结合 TaqMan 探针的反转录环介导等温扩增技术(RT-TaqMan-LAMP)快速检测方法.[方法]根据NDV F基因序列设计特异性引物组和TaqMan探针,以重组质粒pMD-NDV-F为阳性标准品优化反应条件,验证该方法的特异性、灵敏性和重复性,同时与国家标准(GB/T 16550-2020)中推荐的RT-qPCR方法比较,对 70 份实际样本进行验证.[结果]最佳反应条件为 61℃60 min.引物和探针最优浓度:1.6 µmol/L(FIP/BIP)、0.2 µmol/L(F3/B3)、0.8 μmol/L(LF/LB)、0.2 µmol/L(GTP).最低检测限为 1.651×102 copies/µL,灵敏性是LAMP方法的100倍.无非特异性扩增,与禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)、鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum,MG)、鸡滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS)、鸡传染性囊病病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)及疱疹病毒(herpes virus,HSV)均无交叉反应,批次内和批次间变异系数(coefficient of variation,CV)均小于 3%.在 70 份临床样品的检测中本方法比RT-qPCR方法多检测出 1 份阳性样本,经 2 次复测二者的符合率为 98.57%.[结论]本研究建立的NDV RT-TaqMan-LAMP检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好,并能有效避免非特异性扩增,可用于NDV的精准检测和流行病预防.