Investigations on the allergenicity of gluten and hydrolyzed wheat proteins in wheat‐dependent exercise‐induced anaphylaxis

In the spectrum of wheat‐related disorders, WDEIA is defined as immediate type‐1 allergy. It is rare, but potentially life‐threatening and caused by the exposition to wheat proteins and the presence of one or more cofactors. Patients suffer from anaphylactic reactions affecting the gastrointestinal and respiratory tracts, the skin and the cardiovascolar system with different severity. GPT, the storage proteins of wheat, are the most commonly reported WDEIA allergens. Thereby, the ω5‐gliadins are known as major allergens and the HMW‐GS as minor allergens. Reactions to other GPT and HWP are also reported. The golden standard to diagnose WDEIA is still an OFC, which puts patients at risk of anaphylaxis. The aim of this work was to further investigate the allergenicity of gluten and HWP in the context of WDEIA to contribute to a better understanding of the underlying mechanisms and expand diagnostic possibilities. First gluten and HWP were comparatively characterized (SDS‐PAGE, content of free ammonium and RP‐/GP‐HPLC). Based on the results, products were selected from which ATS were prepared in order to investigate the BAT‐FACS as a possible alternative diagnostic tool. Thereby, anti‐ CCR3‐PE‐mAb (BG identification marker) and anti‐CD63‐FITC‐mAb (BG activation marker) were used. Second, patient studies with control subjects were carried out. The results showed that the BAT‐FACS is very promising to supplement WDEIA routine diagnosis, as especially the ATS from ω5‐gladins and sHWP showed very good test sensitivity and specificity. Individual senzitization profiles of the patients were generated after isolation of single GPT and their application as ATS in the BAT‐FACS study. Gluten from a wheat/rye translocation line (G‐ω5, 89% reduced content of ω5‐gliadins in comparison to representative gluten G) was also applied in the BAT‐FACS study to evaluate whether this could possibly be used as a hypoallergenic food. However, allergenic basophil activations in patients were documented, consequently this product is not recommended as hypoallergenic food for WDEIA patients. Our findings still leave a wheat‐free diet and/or avoidance of cofactors as the only safe option for WDEIA patients. Further on, fast and easily preparable ATS, usable in clinical routine diagnosis where elaborate preparations are unwanted, were generated and sucessfully tested on patients and controls. Thereby, a detailed characterization of the contained proteins in the ATS was performed (SDS‐PAGE, RP‐/GP‐HPLC and proteomics‐based untargeted high‐resolution UPLC‐TripleTOF‐MS). These results together with the determined BAT results indicated that non‐gluten proteins are also relevant allergens in the context of WDEIA since high percentages of ATIs were determined in the ATS (G, G‐ω5, sHWP). In addition, yet unidentified allergenic epitopes need to be present in the fast preparable ATS (G, G‐ω5, sHWP, eHWP) because the identified proteins were searched for known WDEIA epitopes and only one epitope was found. Consequently, the known epitopes cannot explain the allergenic basophil activations triggered by these ATS in WDEIA patients. Innerhalb des Spektrums der weizenbedingten Erkrankungen wird die WDEIA als unmittelbare Typ‐1‐ Allergie definiert. Sie ist selten, aber potenziell lebensbedrohlich und wird durch die Exposition gegenüber Weizenproteinen und das Vorhandensein eines oder mehrerer Kofaktoren verursacht. Die Patienten leiden unter anaphylaktischen Reaktionen, die den Magen‐Darm‐Trakt, die Atemwege, die Haut und das kardiovaskuläre System in unterschiedlichem Ausmaß betreffen. Glutenprotein Typen (GPT), die Speicherproteine des Weizens, sind die am häufigsten beschriebenen WDEIA‐Allergene. Dabei sind die ω5‐Gliadine als Hauptallergene und die HMW‐GS als Nebenallergene bekannt. Es wird auch über Reaktionen auf andere GPT und hydrolysiertes Weizenprotein (HWP) berichtet. Der goldene Standard für die WDEIA Diagnose ist nach wie vor eine orale Provokationstestung mit dem verursachenden Lebensmittel oder Gluten, die die Patienten dem Risiko einer Anaphylaxie aussetzt. Ziel dieser Arbeit war es, die Allergenität von Gluten und HWP im Kontext der WDEIA zu untersuchen, um zu einem besseren Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen und Erweiterung der diagnostischen Möglichkeiten beizutragen. Zum einen wurden Gluten und HWP vergleichend charakterisiert (SDS‐PAGE, Gehalt an freiem Ammonium und RP‐/GP‐HPLC). Auf dieser Grundlage wurden Produkte ausgewählt, aus denen allergene Testlösungen (ATS) hergestellt wurden, um den basophilen Aktivierungstest kombiniert mit fluoreszenz‐aktivierter Zellsortierung (BATFACS) als alternative Diagnosemöglichkeit für WDEIA zu untersuchen. Dabei wurden Anti‐CCR3‐phycoerythrin‐ monoklonale Antikörper (Identifikationsmarker für Basophile Granulozyten) und Anti‐CD63‐ Fluoresceinisothiocyanat‐monoklonale Antikörper (Aktivierungsmarker für Basophile Granulozyten) verwendet. Es wurden anschließend Patientenstudien mit Kontrollpersonen durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass der BAT‐FACS eine vielversprechende Ergänzung zur Routinediagnostik der WDEIA darstellt, da insbesondere die ATS aus ω5‐Gladinen und je sHWP je eine sehr gute Testsensitivität und ‐spezifität aufwiesen. Durch die Isolierung einzelner GPT und deren Verwendung als ATS in der BAT‐FACS‐Studie wurden individuelle Sensibilisierungsprofile der Patienten erstellt. Gluten aus einer Weizen/Roggen‐Translokationslinie (G‐ω5, 89% reduzierter Gehalt an ω5‐Gliadinen im Vergleich zu repräsentativem Gluten G) wurde ebenfalls in der BAT‐FACS‐Studie eingesetzt, um zu evaluieren, ob dies möglicherweise als hypoallergenes Lebensmittel verwendet werden könnte. Es wurden jedoch allergene basophile Aktivierungen bei Patienten dokumentiert, so dass dieses Produkt nicht als hypoallergenes Lebensmittel für WDEIA‐Patienten zu empfehlen ist. Unsere Ergebnisse zeigen, dass eine weizenfreie Ernährung und/oder die Vermeidung von Kofaktoren die einzige sichere Option für WDEIA‐Patienten ist. Weiterhin wurden schnelle und einfach zuzubereitende ATS generiert, die in der klinischen Routinediagnostik eingesetzt werden können, wo aufwendige Zubereitungen unerwünscht sind. Diese ATS wurden erfolgreich an Patienten und Kontrollen getestet. Dabei wurde eine detaillierte Charakterisierung der in den ATS enthaltenen Proteine durchgeführt (SDS‐PAGE, RP‐ /GP‐HPLC und Proteom‐basierte nicht‐zielgerichtete hochauflösende UPLC‐TripleTOF‐MS). Diese Ergebnisse deuten zusammen mit den ermittelten BAT‐FACS Ergebnissen darauf hin, dass auch NichtGluten‐Proteine relevante Allergene im Rahmen der WDEIA sind, da hohe Mengen an α‐Amylase‐ Trypsin‐Inhibitoren in den ATS bestimmt wurden (G, G‐ω5, sHWP). Darüber hinaus zeigte sich, dass in den einfach‐herstellbaren ATS (G, G‐ω5, sHWP, eHWP) nicht identifizierte allergene Epitope vorhanden sein müssen, da die identifizierten Proteine auf bekannte WDEIA‐Epitopen analysiert wurden und lediglich eines der bekannten Epitope gefunden wurde. Folglich können die allergenen basophilen Aktivierungen bei den WDEIA‐Patienten nicht durch das Vorhandensein bekannter WDEIA‐ Epitope erklärt werden.