Species differences in the host factor ANP32A/B result in the restriction of avian influenza virus polymerase (vPol) in mammalian cells. Efficient replication of avian influenza viruses in mammalian cells often requires adaptive mutations, such as PB2-E627K, to enable the virus to use mammalian ANP32A/B. However, the molecular basis for the productive replication of avian influenza viruses without prior adaptation in mammals remains poorly understood. We show that avian influenza virus NS2 protein help to overcome mammalian ANP32A/B-mediated restriction to avian vPol activity by promoting avian vRNP assembly and enhancing mammalian ANP32A/B-vRNP interactions. A conserved SUMO-interacting motif (SIM) in NS2 is required for its avian polymerase-enhancing properties. We also demonstrate that disrupting SIM integrity in NS2 impairs avian influenza virus replication and pathogenicity in mammalian hosts, but not in avian hosts. Our results identify NS2 as a cofactor in the adaptation process of avian influenza virus to mammals.
H5N1 avian influenza viruses bearing the clade 2.3.2.1 hemagglutinin (HA) gene have been widely detected in birds and poultry in several countries. During our routine surveillance, we isolated 28 H5N1 viruses between January 2017 and October 2020. To investigate the genetic relationship of the globally circulating H5N1 viruses and the biological properties of those detected in China, we performed a detailed phylogenic analysis of 274 representative H5N1 strains and analyzed the antigenic properties, receptor-binding preference, and virulence in mice of the H5N1 viruses isolated in China. The phylogenic analysis indicated that the HA genes of the 274 viruses belonged to six subclades, namely clades 2.3.2.1a to 2.3.2.1f; these viruses acquired gene mutations and underwent complicated reassortment to form 58 genotypes, with G43 being the dominant genotype detected in eight Asian and African countries. The 28 H5N1 viruses detected in this study carried the HA of clade 2.3.2.1c (two strains), 2.3.2.1d (three strains), or 2.3.2.1f (23 strains), and formed eight genotypes. These viruses were antigenically well-matched with the H5-Re12 vaccine strain used in China. Animal studies showed that the pathogenicity of the H5N1 viruses ranged from non-lethal to highly lethal in mice. Moreover, the viruses exclusively bound to avian-type receptors and have not acquired the ability to bind to human-type receptors. Our study reveals the overall picture of the evolution of clade 2.3.2.1 H5N1 viruses and provides insights into the control of these viruses.
Due to the fact that many avian influenza viruses that kill chickens are not lethal to ducks, farmers are reluctant to use avian influenza inactivated vaccines on ducks. Large numbers of unvaccinated ducks play an important role in the transmission of avian influenza viruses from wild birds to domestic poultry, creating a substantial challenge to vaccination strategies for avian influenza control. To solve this problem, we constructed a recombinant duck enteritis virus (DEV), rDEV-dH5/H7, using a live attenuated DEV vaccine strain (vDEV) as a vector. rDEV-dH5/H7 carries the hemagglutinin gene of two H5 viruses [GZ/S4184/17 (H5N6) (clade 2.3.4.4 h) and LN/SD007/17 (H5N1) (clade 2.3.2.1d)] and an H7 virus [GX/SD098/17 (H7N9)]. These three hemagglutinin genes were stably inherited in rDEV-dH5/H7 and expressed in rDEV-dH5/H7-infected cells. Animal studies revealed that rDEV-dH5/H7 and vDEV induced similar neutralizing antibody responses and protection against lethal DEV challenge. Importantly, rDEV-dH5/H7 induced strong and long-lasting hemagglutinin inhibition antibodies against different H5 and H7 viruses and provided complete protection against challenges with homologous and heterologous highly pathogenic H5 and H7 influenza viruses in ducks. Our study shows that rDEV-dH5/H7 could serve as an ideal live attenuated vaccine to protect ducks against infection with lethal DEV and highly pathogenic avian influenza viruses.
Subgroup K avian leukosis virus (ALV-K) is a novel subgroup of ALV isolated from Chinese native chickens. As for a retrovirus, the interaction between its envelope protein and cellular receptor is a crucial step in ALV-K infection. Tva, a protein previously determined to be associated with vitamin B12/cobalamin uptake, has been identified as the receptor of ALV-K. However, the molecular mechanism underlying the interaction between Tva and the envelope protein of ALV-K remains unclear. In this study, we identified the C-terminal loop of the LDL-A module of Tva as the minimal functional domain that directly interacts with gp85, the surface component of the ALV-K envelope protein. Further point-mutation analysis revealed that E53, L55, H59, and G70, which are exposed on the surface of Tva and are spatially adjacent, are key residues for the binding of Tva and gp85 and facilitate the entry of ALV-K. Homology modeling analysis indicated that the substitution of these four residues did not significantly impact the Tva structure but impaired the interaction between Tva and gp85 of ALV-K. Importantly, the gene-edited DF-1 cell line with precisely substituted E53, L55, H59, and G70 was completely resistant to ALV-K infection and did not affect vitamin B12/cobalamin uptake. Collectively, these findings not only contribute to a better understanding of the mechanism of ALV-K entry into host cells but also provide an ideal gene-editing target for antiviral study.
Highly pathogenic avian influenza (HPAI) subtype H5N1 clade 2.3.4.4b virus has spread globally, causing unprecedented large-scale avian influenza outbreaks since 2020. In 2021, we isolated 17 highly pathogenic avian influenza H5N1 viruses from wild birds in China. To determine virus origin, we genetically analyzed 1,529 clade 2.3.4.4b H5N1 viruses reported globally since October 2020 and found that they formed 35 genotypes. The 17 viruses belonged to genotypes G07, which originated from eastern Asia, and G10, which originated from Russia. The viruses were moderately pathogenic in mice but were highly lethal in ducks. The viruses were in the same antigenic cluster as the current vaccine strain (H5-Re14) used in China. In chickens, the H5/H7 trivalent vaccine provided complete protection against clade 2.3.4.4b H5N1 virus challenge. Our data indicate that vaccination is an effective strategy for preventing and controlling the globally prevalent clade 2.3.4.4b H5N1 virus.
Genetic changes have occurred in the genomes of prevalent African swine fever viruses (ASFVs) in the field in China, which may change their antigenic properties and result in immune escape. There is usually poor cross-protection between heterogonous isolates, and, therefore, it is important to test the cross-protection of the live attenuated ASFV vaccines against current prevalent heterogonous isolates. In this study, we evaluated the protective efficacy of the ASFV vaccine candidate HLJ/18-7GD against emerging isolates. HLJ/18-7GD provided protection against a highly virulent variant and a lower lethal isolate, both derived from genotype II Georgia07-like ASFV and isolated in 2020. HLJ/18-7GD vaccination prevented pigs from developing ASF-specific clinical signs and death, decreased viral shedding via the oral and rectal routes, and suppressed viral replication after challenges. However, HLJ/18-7GD vaccination did not provide solid cross-protection against genotype I NH/P68-like ASFV challenge in pigs. HLJ/18-7GD vaccination thus shows great promise as an alternative strategy for preventing and controlling genotype II ASFVs, but vaccines providing cross-protection against different ASFV genotypes may be needed in China.
本实验室前期研究发现了未见报道的副结核分枝杆菌(MAP)GDSL脂肪酶家族蛋白MAP_2739.为进一步分析MAP_2739的酶学特性,本实验利用生物信息学网站和软件对MAP_2739保守结构域、二级结构、3D同源建模等分析,进一步确认其属于GDSL脂肪酶家族蛋白.以MAP参考株基因组DNA为模板,PCR扩增获得map_2739目的基因约891 bp,克隆于表达载体pET-22b中,构建重组质粒pET-22b-map_2739,转化大肠杆菌感受态细胞,经IPTG诱导表达、蛋白复性、Ni-TNA柱亲和层析纯化后,利用SDS-PAGE分析目的蛋白的表达及纯化效果,并通过western blot鉴定.结果显示,获得了以包涵体形式表达的经复性的纯化重组MAP_2739蛋白(rMAP_2739).利用该蛋白制备兔多克隆抗体,通过ELISA方法检测,多抗血清效价为1∶51 200.经差速离心法分离MAP参考株组分,利用该多克隆抗体为一抗,通过western blot检测,结果显示在细胞壁、细胞膜和细胞浆均出现35 ku的特异性条带,表明MAP_2739为胞外蛋白.以对硝基苯基酯(p-NPs)为底物进行酶活测定,结果显示MAP_2739蛋白为脂肪酶,可水解短链和长链脂肪酸,其最适酶反应pH值为9.0,且rMAP_2739蛋白经巴氏消毒法预处理后,仍具有脂肪酶活性.以重组质粒pET-22b-map_2739为模板,利用各定点突变引物,经PCR扩增各突变的map_2739基因,并测序后转化大肠杆菌感受态细胞,通过western blot鉴定蛋白表达及纯化情况,并进行了酶活测定分析,结果显示获得各定点突变纯化蛋白,确定S46和D204为MAP_2739的酶活性位点.综上所述,本研究首次证明MAP_2739是MAP胞外GDSL脂肪酶,该结果为进一步研究其在MAP致病中的作用机制奠定了基础.
为制备鸭甲型肝炎病毒(DHAV)VP0蛋白的单克隆抗体(MAb),本实验经PCR扩增DHAV-1和DHAV-3的VP0基因并克隆至原核表达载体pMAL-c5x中分别构建重组质粒pMAL-c5x-DHAV1-VP0和pMAL-c5x-DHAV3-VP0.重组质粒均经PCR和测序鉴定正确后转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,采用IPTG诱导表达,并经亲和层析的方法纯化后,采用SDS-PAGE检测两个重组蛋白的表达与纯化效果.SDS-PAGE结果显示,分别在约70 ku处出现目的条带,且纯化后的条带较单一.表明两种重组VP0蛋白(DHAV-1 rVP0和DHAV-3 rVP0蛋白)均获得了表达,且纯化效果均较好.采用纯化的DHAV-1 VP0和DHAV-3 VP0蛋白交叉免疫BALB/c小鼠4次,并在冲击免疫后3 d收获小鼠脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合,采用间接ELISA方法筛选能够稳定分泌DHAV-1 VP0及DHAV-3 VP0蛋白抗体且MBP蛋白抗体为阴性的杂交瘤细胞株,采用试剂盒鉴定MAb的亚类.结果显示,获得了针对DHAV-1及DHAV-3 VP0蛋白的MAb 1H10,且其为IgG1亚型,轻链为κ链.将构建的表达DHAV-1及DHAV-3 VP0蛋白的重组真核表达质粒经PCR和测序鉴定正确后分别转染HEK293T细胞,24 h后以该MAb作为一抗,分别采用western blot和间接免疫荧光试验(IFA)鉴定.结果显示,转染两种重组质粒的细胞均在35 ku处出现特异性条带,且细胞中均出现特异性绿色荧光,而转染空载体的对照细胞无该条带和绿色荧光.表明制备的MAb可以用于western blot 和IFA鉴定DHAV-1和DHAV-3 VP0蛋白的表达.通过对VP0基因截短表达并采用western blot鉴定其识别的抗原表位,并对该表位的氨基酸序列与NCBI数据库中VP0蛋白的氨基酸序列比对.结果显示,MAb 1H10识别的线性表位为VP0蛋白的184LRTNTEIDL192,该表位与不同年代和不同地域分离的DHAV-1及DHAV-3 VP0蛋白相应氨基酸序列的同源性均为100%.表明该抗原表位在不同DHAV分离株中的保守性很高.本研究为DHAV检测方法的建立及具有广谱保护性表位疫苗的设计提供实验参考.
为了探究tRNA修饰酶MnmE对胸膜肺炎放线杆菌(APP)生长特性及致病性的影响,本研究以血清7型APP S8株DNA为模板经PCR分别扩增其MnmE基因的保守结构域及全长基因,分别构建重组质粒pmnmE及pls88-MnmE,并经PCR鉴定正确后将重组质粒pmnmE通过接合转移方式导入受体菌S8中,利用氯霉素抗性筛选MnmE基因缺失株(S8ΔMnmE),并经PCR和测序鉴定;将重组质粒pls88-MnmE电转化至S8ΔMnmE感受态细胞中,经卡那抗性筛选MnmE全长基因回补株(cS8ΔMnmE),并经PCR和测序鉴定.将上述两株菌分别在无抗性培养基中传10代每代均经相应PCR鉴定其遗传稳定性.采用qRT-PCR检测MnmE基因突变对其上下游基因转录水平的影响.结果显示,突变株S8ΔMnmE和回补株cS8ΔMnmE均正确构建,且遗传稳定性均较好;qRT-PCR结果显示,S8ΔMnmE株MnmE上下游基因的转录水平均与亲本株无明显差异.通过检测不同时间点的OD600nm值并绘制生长曲线分析上述两种菌与亲本株分别在20种不同氨基酸单独缺失培养基中的生长特性;通过微量结晶紫染色法,测定3株菌在不同培养时间生物被膜(BF)的形成能力;通过测定3株菌在不同浓度H2O2中的增殖能力,分析3株菌的体外抗氧化应激能力.结果显示,S8、S8ΔMnmE及cS8ΔMnmE株在含全部20种氨基酸的化学合成培养基中的增殖速度基本一致,但在谷氨酰胺(Gln)、色氨酸(Trp)、谷氨酸(Glu)缺失时,S8ΔMnmE株的增殖水平明显低于亲本株,而在甲硫氨酸(Met)、赖氨酸(Lys)缺失时S8ΔMnmE株的生长速度快于亲本株.培养36 h、48h时各菌株BF的形成能力基本无差异,但在培养72 h时,S8ΔMnmE株BF的形成能力约为亲本株的1.5倍(P＜0.001);与S8株相比,S8ΔMnmE株经不同浓度H2O2处理后的活菌数均明显降低,且降低水平与H2O2的浓度成正比.而回补株则基本恢复了亲本株的生长特性.通过对大蜡螟的致病性试验测定S8与S8ΔMnmE的半数致死量(LD50),结果显示S8的LD50为3.16×108cfu/mL,S8ΔMnmE株的LD50为1.58×109 cfu/mL,前者比后者升高约5倍.本研究结果首次表明MnmE可参与APPBF的形成,并影响其体外抗氧化应激能力及调控APP生长,降低APP的致病性.为进一步阐明APP的致病机制提供参考依据.
为建立兔多杀性巴氏杆菌(Pm)和兔出血症病毒(RHDV)的双重PCR检测方法,本研究根据Pm kmt1基因和RHDV VP60基因保守区域,设计2对特异性引物,经PCR分别扩增Pm kmt1基因和RHDV VP60基因保守区域,构建重组质粒pMD-Pm和pMD-RHDV,并经菌液PCR和测序鉴定后作为重组质粒标准品.经各反应条件优化后初步建立了检测Pm和RHDV的双重PCR方法.反应条件优化结果显示,该方法的最适退火温度为59℃,扩增kmt1和VP60基因的最优引物浓度均为0.5 μL(10 μmol/L).对Pm和RHDV及其他病原包括兔源支气管败血波氏杆菌、产气荚膜梭菌等20种相关病原的特异性试验结果显示,除Pm和RHDV有特异性扩增条带外,其余相关病原均无扩增条带,特异性较强.将两种重组质粒标准品分别10倍倍比稀释并等体积混合后作为模板,经该双重PCR方法扩增.结果显示,该方法对pMD-Pm的检测限为17.9拷贝/μL,对pMD-RHDV的检测限为1260拷贝/μL,敏感性较高;对两种病原的DNA和cDNA混合物的批内和批间重复性试验结果均一致,重复性较好.对100份临床患病兔肺脏样品的检测结果显示,Pm和RHDV的阳性率分别为13％(13/100)和7％(7/100),二者混合感染率为37％(37/100),与已报道的Pm和RHDV单一PCR方法的检测结果均一致.表明该方法检测的准确性较高,可以用于临床样品的检测.本研究建立的同时快速检测Pm和RHDV的双重PCR方法为临床这两种病的诊断提供了技术支持.
马腺疫是由马链球菌马亚种(S.equi)引起的急性接触性马属动物传染病,严重影响幼驹的生长发育.我国尚无预防该病的有效疫苗,也缺乏S.equi动物感染和免疫保护模型.为在原核系统中表达马链球菌马亚种(S.equi)的多组分融合蛋白,并评价其对小鼠的免疫保护效果,本研究以S.equi HLJ2018株DNA为模板,分别经PCR扩增其cne、eag、SclC、SclI、SclF、eq5、eq8和ideE基因,并分别克隆至pGEX-6p-1载体中,构建表达这8个蛋白的重组质粒并分别经PCR和测序鉴定.通过在各基因之间引入蛋白接头Gly-Gly-Gly编码基因序列并利用同源重组技术依次串联该8个基因,得到融合基因se8,利用其构建重组质粒pET-28a-SE8(His标签)及pGEX-6p-1-SE8(GST标签),均经PCR和测序鉴定后,将这两个表达SE8及分别表达该8个蛋白的重组质粒分别转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达后采用亲和柱层析法纯化,采用SDS-PAGE检测各蛋白的表达及纯化效果;采用western blot检测各蛋白的反应原性.SDS-PAGE结果显示,获得分子量约181 ku的His标签融合8组分重组蛋白SE8(His-SE8)、204 ku的GST标签融合8组分重组蛋白SE8(GST-SE8)及8个单组分重组蛋白,且上述蛋白均以可溶性形式表达;Western blot结果显示,8个单组分重组蛋白均能够与自然感染S.equi的马阳性血清反应,His-SE8能够与自然感染S.equi 的马阳性血清反应,GST-SE8能够与感染S.equi 小鼠的阳性血清反应.上述结果表明,8个单组分重组蛋白及SE8均获得了表达,且纯化效果和反应原性均较好.以纯化的His-SE8(100 μg)添加明矾佐剂后免疫小鼠,利用间接ELISA(iELISA)分别检测免疫后小鼠血清中9种重组蛋白的特异性抗体及His-SE8特异性抗体亚型水平;免疫后28 d,以10倍最小完全致死剂量(MLD)的S.equi 攻击小鼠后评价His-SE8的免疫保护效果,连续14 d每天监测小鼠临床症状、体质量变化和存活率.iELISA结果显示,His-SE8免疫组小鼠可产生该9种蛋白的特异性抗体,其中EQ5、EQ8和CNE的抗体水平较高,SclF、SclI和IdeE的抗体水平较低,SclC、EAG和His-SE8的抗体水平居中,且His-SE8特异性IgG1水平极显著高于IgG2a和IgG2b水平(P<0.0001);免疫保护实验结果显示,攻菌后3 d免疫组小鼠临床症状缓解,其体质量在攻菌后4 d～8 d恢复正常,存活率达100％;对照组小鼠体质量持续下降,且攻菌后7 d内全部死亡.上述结果表明,His-SE8具有较强的免疫调节和免疫原性,能够诱导小鼠产生高水平的体液免疫应答,具有良好的免疫保护效果.本研究为马腺疫亚单位疫苗的研究提供了参考依据.
为探究近几年猪伪狂犬病病毒(PRV)在我国的流行情况及遗传演化特征,本研究对2016年～2021年采自全国17个省、市和自治区的2299份临床样品经PCR检测,并利用PCR扩增阳性样品中的PRV gB、gE和gC基因并测序,采用MegAlign分析三者与GenBank登录的PRV参考株相应基因序列的同源性;利用MEGA 7.0分别构建上述3个基因的遗传进化树,并采用MegAlign分析gB、gE和gC蛋白氨基酸序列的差异,分析其遗传演化及分子特征的变化.结果显示,共扩增出24份PRV阳性样品,阳性率约1.04％,且不同年份及不同地区均有PRV的检出.PRV gB、gE和gC基因序列的同源性及遗传进化分析结果显示,3个基因及其编码氨基酸序列均与2011年以来的PRV变异株同源性最高,且均属于基因Ⅱ型PRV变异株;氨基酸序列比对结果显示,与基因Ⅰ型PRV相比,所测PRV gB、gE和gC中均存在特征性氨基酸突变位点:gB氨基酸序列aa75～aa77连续缺失3个氨基酸(SPG),aa93～aa94连续插入2个氨基酸(DG);gE氨基酸序列在aa48和aa496各插入1个氨基酸(D);gC氨基酸序列在aa63～aa69连续插入7个氨基酸AAASTPA.此外,本研究通过比对国内外经典株以及2011年以来国内PRV gE蛋白的氨基酸序列,确定了不同亚型PRV(即指基因Ⅱ型PRV变异株和经典株)的分子特征即基因Ⅱ型PRV变异株:gE aa496为"D+"或aa496为"D-"+aa448"I";基因Ⅱ型PRV经典株:gE为aa496"D-"+aa448"V/A".上述结果表明,我国现阶段仍以基因Ⅱ型PRV变异株的流行为主,进一步明确了不同基因型和亚型PRV的分子特征,对了解我国PRV的流行现状及当前流行株的分子特征具有重要意义,为PRV诊断试剂的研发及PR的防控提供了参考.
结核分枝杆菌复合群(MTBC)、包括结核分枝杆菌(MTB)、牛分枝杆菌(MB)、非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌等;非结核分枝杆菌(NTM)中禽分枝杆菌(MA)是自然界常见的动物致病菌,包含4个亚种,分别为禽分枝杆菌禽亚种(MAA)、禽分枝杆菌人/猪亚种(MAH)、禽分枝杆菌副结核亚种/副结核分枝杆菌(MAP)和禽分枝杆菌森林土壤亚种(MAS).为建立MTBC、MAP和MAA的多重荧光定量PCR检测方法,本研究基于MTBC、MAP和MAA的特异性基因devR、F57和IS901分别设计引物及探针,通过优化各反应条件,建立了一种可同时检测3种分枝杆菌的多重TaqMan荧光定量PCR方法.特异性试验结果显示,该方法对MTB、MB、MAP、MAA和MAS检测为阳性,对其他畜禽病原菌,包括MAH、13种NTM和7种非分枝杆菌检测结果均为阴性,特异性较强.敏感性试验结果显示,该方法对MB、MAP和MAA重组质粒标准品的检测限均为1.0拷贝/μL,敏感性较高;重复性试验结果显示,批内与批间重复性试验变异系数均小于2.5％,重复性较好.利用该方法检测体外模拟污染(MB、MAP和MAA菌液浓度分别为1.0×103cfu/mL～1.0x 100cfu/mL)的27份牛抗凝血和12份牛淋巴结组织样品,确定该方法对3种菌的检测限,结果显示该方法对3种菌的检测限均为1.0cfu/mL～10.0cfu/mL.将浓度为1.0×106cfu/mL的MB、MAP和MAA菌液分别单一、两两混合、三种菌混合感染BALB/c小鼠,5d后,剖杀各组小鼠并取各组织及血液样品,同时采用该方法、常规单一PCR及细菌分离培养方法检测,比较三者的检测结果.结果显示,多重荧光定量PCR方法对不同感染组小鼠的各组织样品检出率为98.1％(212/216),常规单一PCR方法的检出率为81.5％(176/216),细菌分离培养的检出率为52.8％(114/216),多重荧光定量PCR与常规单一PCR的阳性符合率均为100.0％(176/176),与细菌分离培养鉴定结果的阳性符合率均为100.0％(114/114).本研究首次建立了能够同时检测MTBC、MAP和MAA的TaqMan多重荧光定量PCR方法,其特异性强、敏感性高、重复性及稳定性好,检测性能强,可以用于临床各种样品的检测,为这3种病原的快速检测和流行病学调查提供了技术手段.
为研究与猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)结合的猪氨基肽酶N(pAPN)受体核心区对TGEV复制以及细胞功能的影响,本研究检索并分析pAPN与TGEV的结合位点,结果显示,敲除pAPNaa668～aa963对其酶活性无影响.因此,利用CRISPR/Cas9技术构建pAPN与TGEV结合位点敲除细胞系,经PCR和western blot鉴定结果显示,正确构建一株敲除pAPN aa668～aa963的ST细胞系,即敲除pAPN 15-21外显子,命名为KO-ST-15.采用CCK-8和细胞划痕方法检测KO-ST-15细胞的增殖和细胞迁移活性,结果显示,敲除pAPN 15-21外显子对ST细胞增殖和迁移活性均无显著影响.利用RT-qPCR和IFA检测KO-ST-15感染TGEV后病毒复制拷贝数和N蛋白的表达,结果显示,敲除pAPN 15-21外显子可极显著抑制TGEV在ST细胞系中的复制(P＜0.001).利用RT-qPCR检测KO-ST-15感染TGEV后炎症相关基因转录水平变化,结果显示,TGEV感染后KO-ST-15中的IL-6、IL-8和NLRP3(NOD-like receptor protein 3)mRNA转录水平无显著变化,但RIG-Ⅰ和MDA5的转录水平显著上调(P＜0.05).上述结果首次表明,敲除pAPN15-21外显子能够极显著抑制TGEV在ST细胞中的复制,但细胞KO-ST-15的正常生理功能无变化,TGEV不能进入敲除pAPN 15-21外显子的细胞中引起炎症反应,该结果为进一步培育抗病育种猪提供参考依据和候选方案.
为评价猪圆环病毒2型-副猪嗜血杆菌二联亚单位疫苗(以下简称二联苗)对小鼠的免疫保护效果,本研究将猪圆环病毒2型(PCV2)cap基因克隆至pMAL-c5X载体中,并通过原核系统表达了重组Cap蛋白(rCap).通过western blot检测显示原核表达的rCap与PCV2单克隆抗体发生特异性结合,表明rCap具有良好的反应原性.利用本研究室已经纯化并保存的副猪嗜血杆菌(HPS)重组蛋白rCdtB、rAfua和rOPPA,与rCap蛋白以及佐剂ISA201VG混合乳化后制成PCV2-HPS二联亚单位疫苗,疫苗中各蛋白(rCdtB、rAfua、rOPPA、rCap)浓度均为50μg/300μL.将60只6周龄BALB/c小鼠随机均分成免疫组和对照组,采用背部多点注射方式免疫,首免后间隔14d二免.一免后以及二免后的14 d分别通过颌下采血方法采血,通过间接ELISA方法检测各组小鼠血清中的特异性抗体,结果显示,二免后14d,免疫组小鼠血清中CdtB、OPPA、Afua抗体水平分别与PBS+ISA201VG对照组和免疫之前比较均极显著提高(P＜0.0001);利用PCV2免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)抗体检测试剂盒检测各组小鼠血清抗体,结果显示在攻毒前PBS组均未检测到PCV2抗体,免疫组二免后14 d抗体水平为1:800.二免后14 d,将免疫组和PBS组各随机分为3组(每组10只小鼠)进行攻毒保护试验,结果显示二联苗对PCV2攻毒组小鼠的免疫保护率为80％,对HPS5型HN10株攻毒组小鼠的免疫保护率为70％,与对照组比较差异极显著(P＜0.01);对HPS13型ZD12株攻毒组小鼠的免疫保护率为80％,与对照组比较差异极显著(P＜0.001).上述结果首次表明,原核表达的rCap具有良好的免疫原性,PCV2-HPS二联亚单位疫苗对小鼠具有一定的保护效果,为后续PCV2-HPS二联亚单位疫苗的研究奠定了实验基础.
为筛选抗牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的中药,本研究选取大青叶、金银花、鱼腥草、连翘和黄连,测定其对MDBK细胞的最大安全浓度,在此基础上通过计算各药物对病毒的抑制率分析上述中药对IBRV的直接杀伤作用、对IBRV黏附细胞的阻断作用和对IBRV在细胞内的抑制作用,确定上述中药对IBRV的有效抑制率;进一步,利用qPCR方法检测中药与IBRV作用后对MDBK细胞中细胞因子转录水平的影响.结果显示,连翘、金银花、黄连、大青叶和鱼腥草对MDBK细胞的最大药物安全浓度分别是3.125 mg/mL、3.125 mg/mL、0.780 mg/mL、1.560 mg/mL和0.780 mg/mL;大青叶对IBRV的直接杀伤作用最好,金银花对IBRV黏附细胞的阻断作用和对细胞内IBRV复制的抑制作用最好;鱼腥草可显著提高细胞中TNF-α、IL-2和IFN-γ的转录水平(P＜0.001);大青叶可极显著提高细胞中IL-1β、IL-2、IL-4、TNF-α和IFN-γ的转录水平(P＜0.001);黄连可极显著提高细胞中IL-1β的转录水平(P＜0.001).结果表明连翘、金银花、黄连、大青叶和鱼腥草均有抗IBRV作用,其抗病毒方式并不相同,本研究为抗IBRV中药的研发奠定基础.
为研究载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样3F(APOBEC3F)对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)增殖的影响,本研究根据GenBank中登录的猪源APOBEC3F基因序列(EU871586)设计引物,经PCR从苏太猪外周血单个核淋巴细胞中扩增APOBEC3F基因,经测序后构建系统进化树分析其遗传进化特性.结果显示,猪源APOBEC3F基因编码区(CDS)长1 257 bp,编码418个氨基酸,与其他物种该基因的同源性在60%～70%.利用扩增的APOBEC3F基因构建真核表达载体pcDNA3.1(+)5′Flag-APOBEC3F经菌液PCR和测序鉴定正确后,转染Marc-145细胞,采用间接免疫荧光试验(IFA)和western blot鉴定重组APOBEC3F蛋白的表达.IFA结果显示,转染pcDNA3.1(+)5′Flag-APOBEC3F的Marc-145细胞质中出现特异性红色荧光;western blot结果显示,转染pcDNA3.1(+)5′Flag-APOBEC3F的细胞样品在44 ku处有特异性条带,表明猪源APOBEC3F在Marc-145细胞中获得了表达.在Marc-145细胞中转染不同剂量的pcDNA3.1(+)5′Flag-APOBEC3F或不同剂量的针对APOBEC3F的siRNA,过表达或抑制APOBEC3F表达后感染PRRSV,通过RT-qPCR检测PRRSV N基因mRNA的转录水平,采用western blot检测细胞中PRRSV N蛋白的表达水平,采用TCID50测定PRRSV滴度.结果显示,在Marc-145细胞中过表达的APOBEC3F可以显著抑制PRRSV N基因mRNA转录水平(P＜0.01)和N蛋白的表达水平,降低PRRSV滴度(P＜0.01、P＜0.001),表明APOBEC3F具有抑制PRRSV增殖的作用,且抑制效率与重组质粒的转染剂量呈正相关.在Marc-145细胞中抑制APOBEC3F的表达后,PRRSV N基因的mRNA转录水平(P＜0.01)、N蛋白的表达水平与PRRSV滴度(P＜0.05、P＜0.001)均显著升高,表明抑制APOBEC3F的表达具有促进PRRSV增殖的作用,且该促进效率与针对APOBEC3F的siRNA转染剂量呈正相关.本研究首次证明APOBEC3F对PRRSV在Marc-145细胞中的增殖有抑制作用,为研究APOBEC3F功能提供实验依据,也为研究抗PRRSV相关机制的研究提供参考.
为分析临床分离的52株猪源支气管败血波氏杆菌(Bb)在纸片扩散法(K-B)药敏试验中出现的庆大霉素(GEN)异质性耐药(HR)情况,本研究采用微量肉汤稀释法检测52株Bb分离株对GEN的最小抑菌浓度(MIC);采用K-B法检测分离株对GEN的敏感性;通过观察抑菌环内是否有菌落初步筛选疑似GEN HR菌株;采用菌落谱性分析法(PAP)测定初筛菌株的MIC与最大不抑菌浓度(MNIC)的比值,以及耐药亚群菌株的发生频率,验证初筛的HR菌株.结果显示:52株猪源Bb对GEN耐药的菌株占13.46%(7/52),多数分离株的MIC值为2 μg/mL～8 μg/mL,对GEN表现为敏感或中介,占全部菌株的86.54%(45/52),其中Bb48株的MIC为2 μg/mL,抑菌环直径为16 mm属于GEN敏感菌株.通过观察纸片法药敏试验中的抑菌环内是否存在菌落,初步筛选对GEN HR的菌株.结果显示,有7株疑似HR菌株;PAP试验结果显示,6株疑似HR菌株的MIC/MNIC比值均小于8,为假阳性HR菌株,只有Bb48株的MIC/MNIC值为16且耐药亚群发生频率为1.3×10-6,按照标准判定其为GEN HR Bb菌株.从PAP 试验验证的Bb48株中有菌落生长的最高浓度GEN平板上随机挑3株耐药亚群菌株,37℃培养12 h,每小时测一次菌落数,共测12 h连同Bb48株一起绘制生长曲线;将上述试验选取的3株耐药亚群菌株连续传50代,每5代测其MIC值判定耐药亚群菌株的耐药遗传稳定性.生长曲线结果显示Bb48株及其耐药亚群菌株的生长速率均无显著差异(P＞0.05);耐药遗传稳定性试验结果显示,将Bb48株中的3株耐药亚群菌株传代,其中两株菌各代次的MIC均为32 μg/mL,1株菌的MIC为8 μg/mL～32 μg/mL.表明耐药亚群菌株对GEN的耐药性能够有效遗传.上述结果表明,52株猪源Bb中的Bb48为GEN HR菌株,Bb48及其耐药亚群菌株的生长速率基本一致,且对GEN的耐药性能够稳定遗传.本研究首次得到了罕见的对GEN HR的Bb菌株,提示临床中应合理使用GEN,并监测HR菌株的出现,对临床使用GEN治疗猪源Bb感染具有重要指导意义.
为建立猪流行性腹泻病毒(PEDV)可视化反转录-环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法,本研究根据PEDV ORF1a/b基因的保守序列,设计了8组特异性引物,以PEDC cDNA为模板,采用试剂盒推荐的各反应条件经LAMP扩增,根据LAMP反应产物琼脂糖凝胶电泳结果筛选最佳引物组.以筛选的外引物PE2 F3/B3经PCR从PEDV cDNA中扩增ORF1a/b基因,构建重组质粒pPE-ORF1-2并分别经PCR和测序鉴定.结果显示,2号引物组(内引物PE2 FIP/PE2 BIP,外引物PE2 F3/PE2 B3)为最佳引物.PCR和测序鉴定结果表明重组质粒正确构建,经计算其浓度为1.56×1011拷贝/μL,将其稀释1 000倍后作为质粒标准品.为建立检测PEDV的RT-LAMP方法,本研究对该方法的反应时间、反应温度、Mg2+浓度、内、外引物及dNTP浓度进行了优化,结果显示,RT-LAMP反应体系为:60℃反应50 min,Mg2+浓度80 mmol/L,内外引物终浓度分别为32 μmol/L和5 μmol/L,dNTP浓度10 mmol/L;通过在上述体系中加入甲酚红指示剂,初步建立了可视化RT-LAMP检测方法.特异性试验结果显示,该方法仅能检出PEDV,与猪德尔塔冠状病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪传染性胃肠炎病毒均无交叉反应,且阳性管体系颜色由紫红色变为黄色,阴性反应管体系颜色保持紫红色,特异性较强;将重组质粒标准品pPE-ORF1-2 10倍倍比稀释(1.65×100 拷贝/μL～1.65×108拷贝/μL)后作为模板,采用本研究建立的可视化RT-LAMP方法进行敏感性试验,结果显示,该方法对pPE-ORF1-2检测限为10拷贝/μL,比以重组质粒pPE-M-GB为模板,以引物PEGBF/PEGBR的PEDV国标RT-PCR方法的敏感性高1个数量级,敏感性较高;重复性试验结果显示,该方法对不同浓度质粒标准品的批内和批间重复性试验的变异系数均小于5%,重复性较好.对53份临床样品检测结果显示,RT-LAMP和RT-PCR对PEDV的检出率分别为32.1%(17/53)和28.3%(15/53).二者的总符合率为96.2%(51/53).本研究建立的PEDV RT-LAMP检测方法具有特异性强、敏感性高、重复性好、操作简便、结果可视化等优点,为PEDV的现场快速检测提供了新的技术支持.
流感是由流感病毒所引起的一类急性呼吸道疾病. 流感病毒分为4种类型: A (甲)、B (乙)、C (丙)和D (丁). 其中甲型流感病毒(Influenza A virus, IAV)的宿主范围极广, 除了家禽、鸟类以外, IAV还能感染马、猪、海豹、水貂、老虎、犬、猫等哺乳动物以及人类[1]. IAV基因组编码10种必需蛋白,分别为聚合酶碱性蛋白2(PB2)、聚合酶碱性蛋白1 (PB1)、聚合酶酸性蛋白(PA)、血凝素(HA)、核蛋白(NP)、神经氨酸酶(NA)、基质蛋白(M1)、膜蛋白(M2)、非结构蛋白1(NS1)以及非结构蛋白2(NS2),此外其还编码多种附件蛋白, 包括PB1-F2蛋白、PA-X蛋白等.
