Человеческие цитокины, в частности, фактор некроза опухоли-α (ФНО-α) и интерлейкин-4 (ИЛ-4), представляют собой низкомолекулярные регуляторные молекулы плейотропного спектра действия. Учитывая комплексный характер оказываемых белками биологических эффектов, достаточно сложно представить препараты медицинского профиля на их основе. Однако промышленное получение субстанций представляет значимость в виду их активного применения в целях диагностики заболеваний, получения биомедицинских клеточных продуктов и других медицинских технологиях, научных исследованиях в модельных экспериментах in vivo на лабораторных животных и клетках in vitro. Существенно удешевить процесс промышленного получения ИЛ-4 и ФНО-α позволит использование в качестве системы экспрессии грамотрицательных бактерий Escherichia coli, которые хорошо себя зарекомендовали в качестве эффективных продуцентов низкомолекулярных гетерологичных белков. Целью настоящего исследования явилось клонирование и экспрессия рекомбинантных человеческих интерлейкина-4 и фактора некроза опухоли-α в клетках бактерий Escherichia coli. Синтетические гены рассчитывали путем обратной трансляции аминокислотных последовательностей ИЛ-4 и ФНО-α (сигнальные пептиды внеклеточной локализации не учитывали), при этом заменяли редко встречающиеся в E. coli кодоны, сохранив порядка 40% нативных последовательностей. Вводили тандем стоп кодонов ТАА, сайт рестрикции для Nde I (содержит старт-кодон) и Eco RI и подбирали селективные праймеры. Амплификацию синтетических генов осуществляли с помощью ПЦР, очищенные ампликоны и вектор рET24b(+) подвергали рестрикции и лигированию. Полученными лигазными смесями трансформировали клетки штамма E.coli XL-1 Blue, которые высевали на селективную среду, содержащую канамицин. Дополнительно наличие вставок целевых генов в полученных трансформантах проверяли ПЦР и рестрикционным анализом. Бактерии культивировали в условиях качалочной аэрации (160 об/мин) при 37 °С в среде LB, выделяли рекомбинантные плазмиды и трансформировали ими клетки штамма E. coli BL21-Gold(DE3) с последующей проверкой наличия сконструированных плазмид методом ПЦР. Клетки положительных клонов использовали для получения ночных культур, которые далее разводили в 20 раз и культивировали с аэрацией до ОП600≈0,8. Вводили индуктор изопропил-β-D-тиогалактопиранозид (ИПТГ) в конечной концентрации 0,5 мМ и продолжали культивировать в течение 4 ч. Клеточные пробы отбирали и оценивали эффективность биосинтеза целевых белков электрофоретически в 16%-ном полиакриламидном геле. По данным денситометрического анализа процент накопления ИЛ-4 и ФНО-α превысил 30% от общего белка клетки, что характеризует полученные штаммы-продуценты как эффективные. Далее клетки разрушали под действием гомогенизатора высокого давления. Полученные фракции разделяли центрифугированием. Установили, что ИЛ-4 преимущественно накапливается в тельцах включения E.coli, в то время как ФНО-α в приведенных условиях эффективно фолдируется бактериальными клетками и полностью растворим.
更多
原文链接
分享
引用
