Человеческие цитокины, в частности, фактор некроза опухоли-α (ФНО-α) и интерлейкин-4 (ИЛ-4), представляют собой низкомолекулярные регуляторные молекулы плейотропного спектра действия. Учитывая комплексный характер оказываемых белками биологических эффектов, достаточно сложно представить препараты медицинского профиля на их основе. Однако промышленное получение субстанций представляет значимость в виду их активного применения в целях диагностики заболеваний, получения биомедицинских клеточных продуктов и других медицинских технологиях, научных исследованиях в модельных экспериментах in vivo на лабораторных животных и клетках in vitro. Существенно удешевить процесс промышленного получения ИЛ-4 и ФНО-α позволит использование в качестве системы экспрессии грамотрицательных бактерий Escherichia coli, которые хорошо себя зарекомендовали в качестве эффективных продуцентов низкомолекулярных гетерологичных белков. Целью настоящего исследования явилось клонирование и экспрессия рекомбинантных человеческих интерлейкина-4 и фактора некроза опухоли-α в клетках бактерий Escherichia coli. Синтетические гены рассчитывали путем обратной трансляции аминокислотных последовательностей ИЛ-4 и ФНО-α (сигнальные пептиды внеклеточной локализации не учитывали), при этом заменяли редко встречающиеся в E. coli кодоны, сохранив порядка 40% нативных последовательностей. Вводили тандем стоп кодонов ТАА, сайт рестрикции для Nde I (содержит старт-кодон) и Eco RI и подбирали селективные праймеры. Амплификацию синтетических генов осуществляли с помощью ПЦР, очищенные ампликоны и вектор рET24b(+) подвергали рестрикции и лигированию. Полученными лигазными смесями трансформировали клетки штамма E.coli XL-1 Blue, которые высевали на селективную среду, содержащую канамицин. Дополнительно наличие вставок целевых генов в полученных трансформантах проверяли ПЦР и рестрикционным анализом. Бактерии культивировали в условиях качалочной аэрации (160 об/мин) при 37 °С в среде LB, выделяли рекомбинантные плазмиды и трансформировали ими клетки штамма E. coli BL21-Gold(DE3) с последующей проверкой наличия сконструированных плазмид методом ПЦР. Клетки положительных клонов использовали для получения ночных культур, которые далее разводили в 20 раз и культивировали с аэрацией до ОП600≈0,8. Вводили индуктор изопропил-β-D-тиогалактопиранозид (ИПТГ) в конечной концентрации 0,5 мМ и продолжали культивировать в течение 4 ч. Клеточные пробы отбирали и оценивали эффективность биосинтеза целевых белков электрофоретически в 16%-ном полиакриламидном геле. По данным денситометрического анализа процент накопления ИЛ-4 и ФНО-α превысил 30% от общего белка клетки, что характеризует полученные штаммы-продуценты как эффективные. Далее клетки разрушали под действием гомогенизатора высокого давления. Полученные фракции разделяли центрифугированием. Установили, что ИЛ-4 преимущественно накапливается в тельцах включения E.coli, в то время как ФНО-α в приведенных условиях эффективно фолдируется бактериальными клетками и полностью растворим.

Антигены групп крови человека представляют собой олигосахаридные или белковые молекулы, располагающиеся на поверхности эритроцитов, эндотелия и большинства эпителиальных клеток. В практике трансфузиологии рутинным является тестирование на совместимость антигенов по системам ABO и RHD, которые являются важными для обеспечения безопасности пациента при переливании крови. На основе гликопротеиновых антигенов согласно системе ABO группы крови разделяют на 4 типа: A, B, AB, и O, в зависимости от типа присутствующего антигена. Антигены A, B и H представляют собой углеводные структуры. Олигосахариды синтезируются поэтапно, причем присоединение каждого моносахарида катализируется специфической гликозилтрансферазой. Структурным различием между антигенами групп крови является наличие или отсутствие терминального остатка моносахарида, связанного с предшественником общей цепи в антигенах A, B и H соответственно. Бактериальные гликозидазы могут быть использованы при трансплантации органов для ферментативного отщепления – N-ацетилгалактозамина в случае антигена А и a-галактозы в случае антигена B, что приведет к превращению этих антигенов в универсальный непреобразованный H-антиген и, как следствие, к снижению вероятности острого отторжения трансплантата. В задачу представленного исследования входило получение штаммов-продуцентов бактериальных рекомбинантных гликозидаз. Аминокислотные последовательности a-D-галактозамин галактозидазы и N-ацетил-a-D-галактозамин деацетилазы Flavonifractor plautii взяты из базы данных UniProt – коды доступа P0DTR5 и P0DTR4 соответственно. Для оптимизации экспрессии генов в клетках E. coli путем обратной трансляции определяли нуклеотидные последовательности с заменой редких синонимических кодонов. Последовательности генов бактериальных гликозидаз, синтезированные в виде двухцепочечных фрагментов ДНК (gBlocks), амплифицировали с использованием праймеров, несущих сайты узнавания для рестриктаз. После рестрикции ампликонов и вектора pET-24b(+) в ходе реакции лигирования получены гибридные конструкции, которыми трансформировали компетентные клетки E. coli XL-1 Blue. Наличие вставки в рекомбинантных плазмидах, выделенных из положительных клонов, подтверждено с помощью ПЦР и рестрикционного анализа. Бактерии штамма E. coli XJa(DE3) трансформировали сконструированными плазмидами для экспрессии a-D-галактозамин галактозидазы и N-ацетил-a-D-галактозамин деацетилазы обозначеными pET-24b-aGal и pET-24b-NADA соответственно. Индукцию экспрессии проводили при 37°С в присутствии ИПТГ в конечной концентрации 0,5 мМ в течение 4 часов. Образцы клеточных лизатов индуцированных и неиндуцированных культур клеток затем анализировали в ходе ДСН-ПААГ электрофореза, по результатам которого показано накопление дополнительных белков в индуцированных клетках бактерий, соответствующих по молекулярной массе a-D-галактозамин галактозидазе (около 116 кДа) и N-ацетил-a-D-галактозамин деацетилазе (около 82 кДа) и обладающих гликозидазной активностью.

Specific prevention is one of the most effective methods for the control of infectious diseases causing considerable economic damage to commercial pig farms, among which is porcine pleuropneumonia. In order to improve the effectiveness of preventive vaccination, various immunomodulators that differ in their origin and mechanism of action are used. The paper presents the results of the study of the effect of such products as biferon-S and prostimul containing species-specific recombinant interferons on the immune status of piglets during specific prevention of porcine pleuropneumonia. Tests were carried out in clinically healthy 30–35-day-old piglets immunized with Ingelvac® APPX vaccine (Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH, Germany). It was found that the use of biferon-S and prostimul together with the vaccine administration is accompanied by immune status improvement in the animals, which is manifested as an increase, in comparison with vaccinated animals that received no interferon-containing products (base case), in serum levels of γ-globulins – by 34.6 and 53.7% (in case of prostimul and β-globulins – by 10.1%), total immunoglobulins – by 32.8 and 37.8%, large circulating immune complexes – by 37.5 and 52.6%, a less significant increase in the levels of small complexes and, as a result, pathogenicity coefficient reduction by 5.4 and 12.4%, respectively. Tests for post-vaccination immunity levels in piglets showed a 3.8-fold increase in the levels of specific antibodies against the antigen of porcine pleuropneumonia agent, and in case of the vaccine administration in combination with biferon-S and prostimul – a 4.0-fold and 4.9-fold increase, respectively. The use of prostimul was accompanied by a more considerable improvement of immune status in the piglets, and this is attributable to the fact that vitamins А, Е and С, which have antioxidant properties and improve the effectiveness of interferons, natural resistance and specific immunity, are included in its composition in addition to recombinant type 1 cytokine.

ИНТЕРФЕРОН-TAU И ФОРМИРОВАНИЕ БЕРЕМЕННОСТИ У КОРОВ С.В. ШАБУНИН 1 , А

ИНТЕРФЕРОН-TAU И ФОРМИРОВАНИЕ БЕРЕМЕННОСТИ У КОРОВ С.В. ШАБУНИН 1 , А

телята, сыворотка крови, биохимические показатели, аспартатаминотрансфераза, аланинаминотрансфераза, общий билирубин, общий белок, альбумины, энрофлоксаветферон-Б

The physiological processes of the early stages of pregnancy in cattle are determined by the level of production of progesterone, interferon-tau, and pro-inflammatory cytokines IL-2, TNFα, IFN-γ, providing in adequate concentrations immune and trophic relationships between the mother's body and the developing embryo. The results of the research on the influence of the bovine recombinant interferon-tau-based drug «Tautin», in “Scientific and Production Center ProBioTech” LLC., on blood progesterone, on cortisol, on interleukin IL-2, on tumor necrosis factor - TNFα, on interferons -γ and -tau, and on the insemination effectiveness, in the black-and-white Holstein cows, are presented. Injections of “Tautin” at the stage of placentation provide an increase in the progesterone-synthesizing function of the corpus luteum, modulation of the local production of the main mediators of the immune system - pro-inflammatory cytokines and guarantee the successful implantation of the embryo and its further physiological development. It is shown that three times injections of «Tautin» to cows during nidation and implantation of blastocyst provide the increase of luteal hormone synthesizing function of corpus luteum in comparison with intact animals by 21.5 %, concentration of cortisol in blood by 11.5%, interferon-tau by 36.9%, and decrease of production of proinflammatory cytokines: IL-2 by 24.5%, TNFα by 21.7%, and interferon γ by 28.5%. The effectiveness of artificial insemination of experimental cows was 74.1% at 37.8% in control group. Development of intrauterine embryo grow retardation syndrome has been reduced from 29.4% to 12.5%.